1、為研究各品系錦鯉的抗逆機(jī)理、相互間的抗逆差別,本試驗(yàn)以紅白錦鯉、昭和錦鯉、黃金錦鯉為研究對象,探討持續(xù)熱應(yīng)激下三個(gè)品系錦鯉非特異性免疫指標(biāo)和HSP70基因的表達(dá)量的變化。試驗(yàn)按3.5℃/h的速度將水溫從25℃升至32℃(升溫時(shí)間為2h),在32℃條件下持續(xù)應(yīng)激24h。分別于應(yīng)激前、應(yīng)激后0、4、8、12、16、20、24h取樣,測定血漿補(bǔ)體蛋白3(C3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、堿性磷酸酶(AKP)、髓過氧化物酶(M

2、PO)、全血呼吸爆發(fā)以及心臟組織HSP70基因的相對表達(dá)量。
　　 結(jié)果如下:(1)熱應(yīng)激下三個(gè)品系錦鯉全血呼吸爆發(fā)與應(yīng)激前相比均沒有顯著性的差異(P＞0.05),應(yīng)激前與應(yīng)激后的整個(gè)過程中,昭和錦鯉和紅白錦鯉呼吸爆發(fā)活力顯著性高于黃金錦鯉(P＜0.05)。(2)熱應(yīng)激下黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿C3含量增加,應(yīng)激12～24h血漿C3的濃度顯著性地高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。熱應(yīng)激下昭和錦鯉血漿C3含量降低,應(yīng)激8～20h顯著

3、性低于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。應(yīng)激前昭和錦鯉血漿C3含量顯著性高于紅白錦鯉和黃金錦鯉(P＜0.05),而應(yīng)激結(jié)束時(shí)昭和錦鯉血漿C3顯著性低于黃金錦鯉(P＜0.05),低于紅白錦鯉(P＞0.05)。(3)熱應(yīng)激后三個(gè)品系錦鯉血漿SOD活力均沒有顯著性的差異(P＞0.05)。熱應(yīng)激前后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,黃金錦鯉血漿SOD活力顯著性高于紅白錦鯉和昭和錦鯉(P＜0.05)。(4)熱應(yīng)激下,黃金錦鯉血漿MDA含量總體呈下降趨勢,應(yīng)激8～24

4、h黃金錦鯉血漿MDA顯著性低于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。紅白錦鯉血漿MDA含量先上升后降低,應(yīng)激16h時(shí)顯著高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。熱應(yīng)激后昭和錦鯉血漿MDA呈上升趨勢,應(yīng)激0、8、16～24h時(shí)顯著性高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。應(yīng)激前,黃金錦鯉血漿MDA顯著性高于紅白錦鯉和昭和錦鯉,而在應(yīng)激結(jié)束時(shí)昭和錦鯉血漿MDA顯著性高于紅白和黃金錦鯉(P＜0.05)。(5)應(yīng)激后黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿AKP均高于應(yīng)激前的水平,

5、應(yīng)激后8～24h黃金錦鯉顯著性的高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05),應(yīng)激后12～16h紅白錦鯉顯著性的高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。應(yīng)激后昭和錦鯉血漿AKP均低于應(yīng)激前的水平,應(yīng)激后20h顯著性低于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。應(yīng)激前和應(yīng)激后0～4h,血漿AKP大小為昭和錦鯉＞紅白錦鯉＞黃金錦鯉,應(yīng)激后8-24h血漿AKP大小為紅白錦鯉＞昭和錦鯉＞黃金錦鯉。(6)熱應(yīng)激后黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿MPO與應(yīng)激前的水平相比均無顯著性的變化(

6、P＞0.05)。應(yīng)激后昭和錦鯉血漿MPO的水平均高于應(yīng)激前的水平,應(yīng)激后12、20～24h顯著性高于應(yīng)激前的水平(P＜0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,黃金錦鯉血漿MPO活性均低于昭和錦鯉和紅白錦鯉,除了應(yīng)激后4h和8h。(7)熱應(yīng)激后,三個(gè)品系錦鯉HSP70mRNA的表達(dá)量具有相似的變化趨勢。應(yīng)激Oh時(shí)HSP70mRNA的表達(dá)量顯著性上升(P＜0.05),并且達(dá)到整個(gè)過程的峰值,黃金錦鯉、紅白錦鯉、昭和錦鯉的表達(dá)量分別提高到應(yīng)激前的78.

7、7、27.8和9.9倍。應(yīng)激4～16h,HSP70mRNA的表達(dá)量恢復(fù)到應(yīng)激前的水平,應(yīng)激20h時(shí),HSP70mRNA的表達(dá)量再次升高。在三個(gè)品系錦鯉之間,應(yīng)激后0、20h,HSP70mRNA的相對表達(dá)量為黃金錦鯉＞紅白錦鯉＞昭和錦鯉:應(yīng)激后24h為紅白錦鯉＞黃金錦鯉＞昭和錦鯉,其他時(shí)間三個(gè)品系間無顯著性差異。結(jié)果表明:熱應(yīng)激下三個(gè)品系錦鯉非特異性免疫指標(biāo)和HSP70mRNA表達(dá)呈現(xiàn)不同的變化。熱應(yīng)激顯著性地誘導(dǎo)了三個(gè)品系錦鯉HSP70

8、mRNA的表達(dá),誘導(dǎo)了黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿補(bǔ)體C3和AKP的合成,以及昭和錦鯉MPO的合成。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中三個(gè)品系錦鯉抗病抗逆差異,我們可以推斷熱應(yīng)激下誘導(dǎo)合成的HSP70、C3、AKP和MPO可能在機(jī)體抗逆過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 為進(jìn)一步研究HSP70在魚類抗應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)理,本研究采用5'RACR和3'RACE的方法克隆了錦鯉HSP70基因的全長序列,該序列長度為2289bp,編碼643個(gè)氨基酸。HSP70蛋白

9、預(yù)測分子質(zhì)量為70.46kD,理論等電點(diǎn)為5.47,整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷,在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。氨基酸序列分析顯示,錦鯉HSP70具有HSP70家族的3個(gè)簽名序列,以及HSP70家族細(xì)胞質(zhì)特征基序EEVD和靠近C端的1個(gè)四肽序列GGMP。同源性分析發(fā)現(xiàn)錦鯉HSP70與其他生物的HSP70序列具有較高的同源性,與草魚HSP70氨基酸序列相似性最高達(dá)97.67%,與無脊椎動物果蠅的相似性都高達(dá)73.04%。錦鯉HSP70蛋白無明顯跨膜區(qū)域,無信號肽