1、由于目前普遍采用的剪眼柄催熟法存在很多弊端,對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦繁育機(jī)理進(jìn)行研究以尋找新的安全便利的催熟方法成為突破斑節(jié)對(duì)蝦雌性性腺難以大批量集中成熟問(wèn)題的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究確定了實(shí)驗(yàn)用斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育所處時(shí)期,檢測(cè)了卵巢發(fā)育過(guò)程中血淋巴的四種激素的濃度變化,同時(shí),克隆了與 M期相關(guān)的MPP6基因,研究了 MPP6基因表達(dá)情況及其與卵巢發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因 cyclinB以及 cdc25的表達(dá)差異和相關(guān)性,為進(jìn)一步研究與卵巢發(fā)育相關(guān)的激素和基因間

2、的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ),為研究斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)理提供參考資料。
　　本實(shí)驗(yàn)采用石蠟切片和HE染色技術(shù),結(jié)合解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)技術(shù)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢各分期進(jìn)行分類(lèi)和鑒定,確定了實(shí)驗(yàn)用斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育所處時(shí)期。主要鑒定依據(jù)為卵母細(xì)胞特征,即Ⅰ期卵巢中絕大多數(shù)細(xì)胞為卵原細(xì)胞,細(xì)胞小且細(xì)胞核比較大。Ⅱ期中大多數(shù)卵母細(xì)胞是染色質(zhì)核仁期卵母細(xì)胞和周邊核仁期卵母細(xì)胞。Ⅲ期中已出現(xiàn)少量的卵黃囊卵母細(xì)胞。Ⅳ期中大多數(shù)卵母細(xì)胞是卵黃囊卵母細(xì)胞。Ⅴ期

3、中可見(jiàn)成熟的邊緣布滿(mǎn)皮質(zhì)桿狀體的卵母細(xì)胞。Ⅵ期中多數(shù)卵母細(xì)胞是染色質(zhì)核仁期卵母細(xì)胞和周邊核仁期卵母細(xì)胞及部分皮質(zhì)桿狀體的卵母細(xì)胞。
　　采用化學(xué)發(fā)光法(Chemiluminesence immunoassay，CLIA)檢測(cè)了卵巢發(fā)育階段(Ⅱ期至Ⅵ期)血淋巴中促黃體生成激素(Luteinizing hormone，LH)、促卵泡生成激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、孕酮(Progestero

4、ne，P)和雌二醇(Estradiol，E2)的濃度和變化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卵巢發(fā)育過(guò)程中斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴中促黃體生成激素在卵黃積累階段Ⅱ期至Ⅳ期濃度較高,Ⅱ期約為0.27 mIU/ml和Ⅳ期約為0.24 mIU/ml。卵巢成熟期Ⅴ期濃度最低約為0.10 mIU/ml,而后在恢復(fù)期濃度增大。促卵泡生成激素的濃度在卵巢發(fā)育起始期Ⅱ期達(dá)到峰值(約0.13 IU/ml),而后在卵巢發(fā)育過(guò)程中濃度持續(xù)下降,至卵巢成熟期Ⅴ期濃度最低(約為0.03

5、 IU/ml),而后在恢復(fù)期濃度增加。孕酮濃度在卵巢發(fā)育Ⅱ期緩慢升高,至Ⅵ期增長(zhǎng)為105.3 pg/ml。雌二醇濃度在卵巢發(fā)育期中濃度大致相同,最大值Ⅲ期(77.0 pg/ml)為最小值Ⅳ期(68.7 pg/ml)的1.2倍。斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴中 E2濃度自Ⅱ期卵巢開(kāi)始發(fā)育起一直維持在較高水平,且呈高低交替變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示斑節(jié)對(duì)蝦四種激素與卵巢發(fā)育有關(guān),與其在脊椎動(dòng)物中的功能一致可能發(fā)揮著促進(jìn)卵巢發(fā)育的作用。
　　采用cDNA末端快

6、速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)從斑節(jié)對(duì)蝦總 RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中獲得了堿基長(zhǎng)度為690bp的M期磷酸蛋白6(M-phase phosphoprotein6，MPP6)的全長(zhǎng) cDNA序列,并命名為 PmMPP6。該序列包含68 bp的5’非編碼區(qū)(UTR)和172 bp的3’非編碼區(qū)以及450bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),可編碼149個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)分子量為17.01kDa,理論等電點(diǎn)

7、為4.89。序列比對(duì)分析表明 PmMPP6與致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatus)的相似性和同源性最高。位點(diǎn)分析顯示 PmMPP6無(wú)糖基化位點(diǎn),但是含有六個(gè)磷酸化位點(diǎn),分別為5個(gè) Ser位點(diǎn),1個(gè) Thr位點(diǎn),沒(méi)有Tyr位點(diǎn)。系統(tǒng)樹(shù)分析顯示 PmMPP6歸屬于無(wú)脊椎動(dòng)物大類(lèi)。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)(Quantitative real time PCR，QRT-PCR)對(duì)三種基因進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)的結(jié)果可知,

8、cyclinB的mRNA在所檢測(cè)的卵巢、淋巴、腦、血、肌肉、心、鰓、肝胰腺和腸9種組織中均有不同程度的表達(dá),在卵巢內(nèi)的表達(dá)量最高,淋巴次之,而在肝胰腺中的表達(dá)量最低。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對(duì)蝦 cyclinB基因 mRNA表達(dá)在卵巢中與其他組織存在極顯著性差異(P<0.01)。cyclinB的mRNA在卵巢發(fā)育二至六期中的表達(dá)量大致相同,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。cdc25基因 mRNA在所測(cè)的9種組織中均有不同程度的表達(dá),在心臟中

9、的表達(dá)量最高,肌肉次之,而在鰓中的表達(dá)量最低。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對(duì)蝦 cdc25基因mRNA在組織表達(dá)中存在顯著差異(P<0.05)。斑節(jié)對(duì)蝦 cdc25基因的mRNA在Ⅱ期卵巢表達(dá)量最高,Ⅲ期和Ⅳ期的表達(dá)量最低。在Ⅱ期卵巢中，mRNA相對(duì)表達(dá)量是在Ⅲ期中的1.6倍。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對(duì)蝦 cdc25 mRNA在卵巢發(fā)育期中的表達(dá)存在顯著性差異(P?0.05)。PmMPP6的mRNA在卵巢、淋巴、腦、血、肌肉、心、鰓、肝胰腺和腸