1、甘藍類蔬菜(Brassica oleracea L.)屬于十字花科蕓薹屬,包含結球甘藍、青花菜、花椰菜、球莖甘藍、芥藍、羽衣甘藍、抱子甘藍等七個栽培變種。2006年全國結球甘藍(Brassicaoleracea var.capitata L.)的種植面積達93.73萬公頃。結球甘藍雜交種的生產主要利用自交不親和系和雄性不育系兩種途徑,其中雄性不育系包括顯性核基因雄性不育(DGMS)和改良的Ogura蘿卜胞質不育(CMS)。但雄性不育系的

2、利用存在胞質單一的風險。從分子水平研究甘藍變種間和變種內的細胞質DNA多態(tài)性,為顯性雄性不育系和胞質不育系的胞質多樣化提供科學依據,而且對于闡明甘藍各變種的進化路線具有重要意義。
　　 本研究利用甘藍類蔬菜不同變種間和變種內材料,以開發(fā)的葉綠體SSR(cpSSR)和線粒體SSR(mtSSR)引物進行多態(tài)性篩選；利用全基因組重測序結果,全面揭示六份結球甘藍材料間的細胞質DNA多樣性；以獲得的特異SNP或CAPS標記進行Ogura

3、CMS不育系或DGMS不育系胞質多樣性的驗證。研究結果如下:
　　 1.利用已公布的擬南芥葉綠體、油菜線粒體全基因組序列,首次開發(fā)出可在結球甘藍上應用的cpSSR和mtSSR引物。分別搜索獲得89個葉綠體基因組SSRs(cpSSRs)、29個線粒體基因組SSRs(mtSSRs),SSR出現(xiàn)頻率分別為1.736 kb／1個SSR、7.650 kb／1個SSR。針對這些SSR設計cpSSR引物58對、mtSSR引物21對,能在結球甘

4、藍上應用的cpSSR引物32對、mtSSR引物2l對。在32對cpSSR引物中,5對引物在結球甘藍自交系C300、C322和波里馬油菜N478、N479間有擴增產物多態(tài)性,這些多態(tài)性片段均位于基因內含子區(qū)或基因間隔區(qū)。多態(tài)性片段測序結果顯示單核苷酸A／T重復數(shù)從8個到13個不等,相似性比較表明C300、N479間的相似性大于兩者與擬南芥之間的相似性。21對mtSSR引物均未在甘藍C300、C322和波里馬油菜N478、N479間檢測到多

5、態(tài)性,表明線粒體DNA的保守程度比葉綠體要高。這些細胞質SSR引物在結球甘藍上的成功應用,為甘藍類蔬菜細胞質多樣性研究提供了基礎。
　　 2.利用開發(fā)的cpSSR引物進行甘藍類蔬菜不同變種間細胞質DNA多態(tài)性篩選,首次獲得了具有變種特異性的葉綠體單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記,并成功將其轉化為dCAPS標記。以32對在結球甘藍上應用的cpSSR引物對結球甘藍、青花菜、花椰菜、芥藍、球莖甘藍等5個不同變種進行標記篩選,在聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳上沒有獲得擴增產物長度多態(tài)性。對這32對引物的PCR擴增產物進行測序,利用DNAstar軟件比對發(fā)現(xiàn)1個SNP位點,該位點初步呈現(xiàn)變種特異性。為簡便快速鑒定該SNP位點,將其成功轉化為衍生的酶切擴增多態(tài)性序列(dCAPS)標記-ACP43-93 RsaⅠ。以該dCAPS標記對甘藍類蔬菜不同變種的206份材料進行篩選,進一步驗證了該標記的變種特異性。全部花椰菜和大部分青花菜為同一單元型,其它甘藍變種為另一單元型,由此推測青花菜和花椰

7、菜的分化時間相對較晚。同時,利用三個甘藍變種的雄性不育回交群體明確了該葉綠體SNP為母性遺傳標記。
　　 3.采用Solexa基因組重測序方法,以結球甘藍02-12新組裝的葉綠體和線粒體基因組全長序列為參考,全面揭示六份結球甘藍材料(Ogura CMS R1、R2、R3、自交系60Tian、87-534、DGMS87—534)的葉綠體、線粒體基因組DNA序列多態(tài)性。與02-12相比,異源胞質雄性不育材料Ogura CMS R1、

8、R2、R3在葉綠體基因組水平上的SNP個數(shù)分別為1010、357、62,在線粒體基因組水平上的SNP個數(shù)分別是630、599、108,這些不育系的SNP數(shù)量在Ogura CMS R1、R2、R3中呈現(xiàn)逐步減少的趨勢,表明異源胞質含量越少,胞質不育系的應用前景就好。與結球甘藍自交系Bo-1相比,Ogura CMS R3特有的9個葉綠體SNPs、49個線粒體SNPs、3個線粒體插入和缺失變異(InDels),將為今后Ogura胞質不育系的進

9、一步改良提供有效的篩選標記。在三份結球甘藍材料B0-1、Bo-7、Bo-8中,各自特有的葉綠體SNP個數(shù)分別為4、21、0,線粒體SNP個數(shù)分別為9、18、2,特有的線粒體InDels個數(shù)分別為0、3、0,表明結球甘藍變種內材料間具有細胞質多樣性,為DGMS不育系的胞質多樣化提供依據。
　　 4.以開發(fā)的32對cpSSR和21對mtSSR引物,對兩種可實用的結球甘藍Ogura CMS不育源CMS R3、CMS HY進行分子鑒別,

10、發(fā)現(xiàn)了在可實用Ogura胞質不育源中的胞質多樣性。在cpSSR水平上,無法在聚丙烯酰胺凝膠電泳上獲得多態(tài)性,經測序僅發(fā)現(xiàn)兩種不育源在ACP9引物上存在SSR重復數(shù)的變異。在mtSSR水平上,僅mtSSR2引物可以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上區(qū)分這兩種不育源,經測序發(fā)現(xiàn)其余5對mtSSR引物的擴增產物上存在9個多態(tài)性差異,其中3個為SSR位點重復數(shù)的變異。將其中2個可被MseⅠ酶切的多態(tài)性位點轉化成CAPS標記,分別命名為m92-143 Mse

11、Ⅰ、m1-346MseⅠ。這些標記表明CMS HY是一種不同于CMS R3的改良結球甘藍Ogura CMS雄性不育源。以CMS HY為不育源進行3個優(yōu)良結球甘藍自交系的轉育,現(xiàn)已獲得回交6代、花器官正常、結實性良好的優(yōu)良雄性不育系。因此通過鑒別兩種可實用的Ogura CMS不育源,發(fā)現(xiàn)了在可實用Ogum胞質不育源中的胞質多樣性。
　　 5.采用微量花粉回交法,成功獲得替換胞質的DGMS-T不育系四份,并進行了胞質來源鑒定。以結球

12、甘藍DGMS不育系微量花粉為父本,以不育系相應保持系為母本,雜交后獲得了四份DGMS-T不育系—07-556、07-1005、07-1006、07-1007。田間鑒定表明在DGMS不育系的不育性遺傳、不育穩(wěn)定性、花器官形態(tài)、結實性、田間植株性狀等方面,胞質替換前后并沒有顯著性差異。以DGMS不育源79-399-3及回交父本60Tian間特有的SNP標記和CAPS標記,驗證了不育系DGMS—T60Tian的胞質來源為其回交父本?？傊?本研