1、自1980年世界上第一只轉(zhuǎn)基因小鼠制備成功后,科學(xué)家們就開始進(jìn)行轉(zhuǎn)基因雞的研究,因?yàn)檗D(zhuǎn)基因雞無論在基礎(chǔ)理論研究方面還是在生物技術(shù)領(lǐng)域都具有獨(dú)特的優(yōu)勢,因此建立行之有效的轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)一直是一個研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。
　　 雖然世界上已有成功獲得轉(zhuǎn)基因雞的先例,但國內(nèi)還沒有成功獲得轉(zhuǎn)基因雞的報道。本研究擬以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳蟾婊驊?yīng)用慢病毒載體感染法開展轉(zhuǎn)基因雞制備研究,希望外源基因能夠整合到性腺中,并能夠穩(wěn)定的傳遞給下一代,以在國

2、內(nèi)率先建立起一個行之有效的轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)體系。
　　 種蛋的質(zhì)量是成功獲得轉(zhuǎn)基因雞不可忽視是的一個重要因素。為獲得優(yōu)質(zhì)的種蛋,以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行,我們對周圍幾個雞場的種蛋進(jìn)行篩選。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),大午集團(tuán)的種蛋優(yōu)于其它雞場的種蛋。
　　 對雞胚操作后再進(jìn)行培養(yǎng)的方法有兩種,為開窗術(shù)和代用蛋殼法。在本研究中采用開窗術(shù)進(jìn)行雞胚的培養(yǎng)。在對剛產(chǎn)出的種蛋進(jìn)行消毒處理后,室溫條件下水平放置過夜,使胚胎漂浮到最上端。用70％酒精擦

3、拭后,用電磨在赤道面上鋸一5mmx5mm見方的口后就可以看到胚胎,然后向其中加一定量的稀蛋清,最后用石蠟和封口膜封口。采用變溫孵化。孵化結(jié)果顯示石蠟封口的孵化率高于封口膜封口。
　　 為研究顯微注射所造成的機(jī)械損傷對孵化率的影響。我們開展了向雞胚胚下腔注射DMEM液體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)。對新鮮種蛋消毒和開口處理后,利用顯微注射的方法向胚下腔中注射2～2.5uLDMEM液體培養(yǎng)基。共成功注射25枚種蛋,最后有9只雛雞出殼,其孵化率為36％

4、。結(jié)果顯示我們的注射方法滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
　　 本研究中制備轉(zhuǎn)基因雞的方法為慢病毒載體法。慢病毒載體法是制備轉(zhuǎn)基因雞方法中最為成熟的一種方法。所使用的慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng),即由穿梭質(zhì)粒,包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒構(gòu)成。在穿梭質(zhì)粒中用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為報告基因。采用逐級稀釋法和感染293FT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行病毒滴度的測定。其結(jié)果顯示病毒滴度為1×109感染單位／mL(TU／mL)。
　　 在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因雞制備實(shí)

5、驗(yàn)中,我們向雞胚胚下腔內(nèi)注射2～2.5uL攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體懸液,其滴度為1×109U／mL,對其封口后進(jìn)行孵化。共成功注射110枚種蛋,最后得到了32只原代雞。在雞30日齡時,我們從雞翅靜脈采血,利用酚氯仿抽提方法提取雞血基因組DNA,通過基因組DNA PCR方法擴(kuò)增EGFP和部分載體序列。其中有4只擴(kuò)增出同預(yù)期大小一致目的片段。更為有意義的是,在所養(yǎng)的16只公雞性成熟后,采其精液再利用酚氯仿抽提方法提取精液的基因