1、本研究以‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖葉片為材料,采用RT-PCR和RACE技術(shù),克隆獲得了橄欖葉黃烷酮-3-羥化酶基因(flavonoid3-hydroxylase,F3H)和查爾酮異構(gòu)酶基因(chalcone isomerase,CHI)的cDNA全長(zhǎng)序列以及查爾酮合成酶基因(chaleone synthase,CHS)的部分cDNA序列,為橄欖黃酮化合物的生物合成調(diào)控及開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用RACE和

2、RT-PCR技術(shù)克隆橄欖葉F3H基因cDNA全長(zhǎng)
　　 橄欖葉F3H基因cDNA序列全長(zhǎng)1295 bp,包含一個(gè)完整的開放閱讀框1095bp,5’和3’非編碼區(qū)分別為41 bp和159 bp,編碼364個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量41084.9 Da,理論等電點(diǎn)pI5.47,總平均疏水性為-0.437,不穩(wěn)定系數(shù)為42.34,屬于不穩(wěn)定蛋白。橄欖葉F3H基因cDNA序列與荔枝、柚子、龍眼、甜橙、陸地棉、海島棉的同源性比較高,分別為84

3、％、84％、83％、83％、82％、82％。對(duì)F3H保守區(qū)功能分析結(jié)果顯示,F3H包含三個(gè)結(jié)構(gòu)功能域:20G-FeⅡ-Oxy高度保守區(qū)域、PLN03176和PLN02515結(jié)構(gòu)域。全酶催化以下反應(yīng):ProcollagenL—proline+2-oxoglutarate+O2<=>procollagen trans-4-hydroxy-L-proline+succinate+C02。20G-FeⅡ-Oxy家族還具有賴氨酸水解酶、異青霉素合

4、成酶及AlkB的活性。該序列的GenBank登錄號(hào)為:JF728820。
　　 2.利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆橄欖葉CHI基因cDNA全長(zhǎng)
　　 橄欖葉CHI基因cDNA序列全長(zhǎng)1054 bp,包含一個(gè)開放閱讀框672 bp,5’和3’非編碼區(qū)分別為50 bp和332 bp,編碼223個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量24247.9Da,理論等電點(diǎn)pI5.58,總平均疏水性為0.013,不穩(wěn)定系數(shù)為34.60,屬于穩(wěn)定蛋白。

5、序列對(duì)比表明,橄欖葉CHI基因cDNA序列與溫州蜜柑、甜橙、柚子、楊樹、美洲葡萄的同源性比較高,分別為80％、80％、80％、79％、78％。對(duì)CHI保守區(qū)功能分析結(jié)果顯示,CHI包含一個(gè)Chaleone superfamily保守結(jié)構(gòu)域。查爾酮異構(gòu)酶是植物體內(nèi)催化查爾酮到柚配苷的一種酶,在類黃酮合成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。該序列的GenBank登錄號(hào)為:JF728821。
　　 3.利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆橄欖葉CHS基

6、因cDNA片段
　　 從橄欖葉中克隆獲得的CHS基因cDNA序列長(zhǎng)511 bp,5’非編碼區(qū)堿基數(shù)為117 bp,推測(cè)編碼146個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST分析表明,該cDNA序列與其它多種植物CHS基因具有較高的同源性。對(duì)CHS保守區(qū)功能分析結(jié)果顯示,CHS在16-146位氨基酸之間,包含部分cond_enzymes superfamily結(jié)構(gòu)域。該酶家族是一類縮合酶,催化縮合反應(yīng),各模體之間結(jié)構(gòu)相似性非常高,與脂肪酸的合成和降解、