1、羅非魚(yú)是國(guó)際糧農(nóng)組織向全世界推薦的三大養(yǎng)殖魚(yú)類之一，目前已在全世界范圍內(nèi)推廣開(kāi)來(lái)，其中尼羅羅非魚(yú)是養(yǎng)殖最為廣泛的一個(gè)品種。尼羅羅非魚(yú)雄魚(yú)的生長(zhǎng)速度比雌魚(yú)大約快40%，因此通過(guò)性別控制技術(shù)生產(chǎn)全雄魚(yú)將顯著性提高群體產(chǎn)量，降低餌料系數(shù)。全雄羅非魚(yú)培育技術(shù)和性別特異性分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合將明顯提高全雄羅非魚(yú)的育種效率。本研究中利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚(yú)的XX基因型雌魚(yú)、XY基因型雄魚(yú)和YY基因型超雄魚(yú)的基因組DNA進(jìn)行篩選，最終獲得8

2、條與尼羅羅非魚(yú)X染色體相關(guān)的AFLP條帶，并將其中的一個(gè)條帶轉(zhuǎn)化為X染色體的SCAR標(biāo)記。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，采用PstⅠ和MseⅠ的酶切組合對(duì)XX、XY和YY基因型尼羅羅非魚(yú)基因組DNA雙酶切，再進(jìn)行酶切接頭的連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)256對(duì)選擇性擴(kuò)增引物的篩選，在其中8對(duì)引物(P2M2、P2M11、P5M14、P6M5、P11M5、P14M16、P15M8和P15M13)的擴(kuò)增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)X染色體特異性條帶，并根據(jù)選擇

3、性擴(kuò)增引物對(duì)這8個(gè)條帶進(jìn)行命名。隨后對(duì)這8個(gè)條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序，并根據(jù)其測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組步移，成功獲得4個(gè)條帶(P2M2、P11M5、P15M8和P15M13)的側(cè)翼序列。為了驗(yàn)證這4個(gè)片段及其側(cè)翼序列在X和Y染色體上的序列差異，分別在XX和YY基因型的尼羅羅非魚(yú)中擴(kuò)增這4個(gè)片段及其側(cè)翼的部分序列。通過(guò)測(cè)序結(jié)果的比對(duì)，僅在P15M8的特異性片段中發(fā)現(xiàn)一個(gè)X和Y染色體之間的多態(tài)位點(diǎn)(C/T)。X染色體特異性片段P15M8及其側(cè)翼序列在N

4、CBI中進(jìn)行Blast分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其同源序列，我們認(rèn)為這可能是某個(gè)未知基因的片段。根據(jù)這個(gè)多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)SCAR引物NTX，分別在32個(gè)XX、XY和YY基因型的尼羅羅非魚(yú)中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示XX和XY基因型個(gè)體中都擴(kuò)增得到一條109 bp的條帶，而YY基因型中僅有一個(gè)個(gè)體擴(kuò)增到這一條帶。因此認(rèn)為，引物NTX可以為尼羅羅非魚(yú)超雄魚(yú)PCR鑒定方法的建立提供一些的參考，加快全雄尼羅羅非魚(yú)的育種進(jìn)程。
　　 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(

5、Pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP)是胰高血糖素家族的一員，能夠促進(jìn)生長(zhǎng)激素、促性腺激素和催乳素的分泌，影響大腦發(fā)育和繁殖。本研究利用RT-PCR和RACE方法成功分離尼羅羅非魚(yú)的PACAP基因，該基因cDNA全長(zhǎng)為1013 bp，最大開(kāi)放閱讀框528 bp，編碼175個(gè)氨基酸。通過(guò)PCR-SSCP方法對(duì)尼羅羅非魚(yú)PACAP基因的CDS區(qū)域進(jìn)行SNPs檢測(cè)，在引物P2

6、的SSCP圖譜中呈現(xiàn)出多態(tài)性，將不同的帶型分別命名為AA、AB和BB基因型。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)PACAP基因的第二外顯子部分存在一個(gè)SNP位點(diǎn)(G42A)，該位點(diǎn)沒(méi)有引起編碼氨基端的改變。通過(guò)不同基因型與尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)性狀之間的多重比較結(jié)果顯示，雄性尼羅羅非魚(yú)AA基因型個(gè)體的全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、體厚、尾柄高和體重都顯著性大于AB基因型個(gè)體(P<0.5)。由此認(rèn)為，AA基因型是雄性尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)基因型，AB基因型則是雄性尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)的劣勢(shì)

7、基因型，可以嘗試將SNP位點(diǎn)(G42A)應(yīng)用于雄性尼羅羅非魚(yú)的標(biāo)記輔助選育。
　　 生肌決定因子6(Myogenic factor6，MYF6)是生肌決定因子家族的一員，在肌纖維中大量表達(dá)。該家族還有3個(gè)基因分別為Myf4，Myf5和MyoD，其中Myf5和MyoD基因共同作用于成肌細(xì)胞的生成，Myf6和Myf4基因共同作用于肌小管的分化。這4個(gè)基因之間相互配合，共同在肌肉的分化和形成過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究利用RT-PCR和RA

8、CE方法成功分離尼羅羅非魚(yú)的MYF6基因，該基因cDNA全長(zhǎng)為990 bp，最大開(kāi)放閱讀框678 bp，編碼225個(gè)氨基酸。通過(guò)PCR-SSCP方法對(duì)尼羅羅非魚(yú)MYF6基因的CDS區(qū)域進(jìn)行SNPs檢測(cè)，在引物M2的SSCP圖譜中呈現(xiàn)出多態(tài)性，將不同的帶型分別命名為AA、AB和BB基因型。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)MYF6基因第一外顯子部分存在一個(gè)SNP位點(diǎn)(G137T)，該位點(diǎn)沒(méi)有引起編碼氨基端的改變。通過(guò)不同基因型與尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)性狀之間的多重比較