1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草，北方寒冷的天氣嚴(yán)重影響紫花苜蓿的產(chǎn)量。紫花苜蓿在寒冷冬季的存活率取決于根頸芽的數(shù)量和返青能力。為了研究紫花苜?？购缘姆肿訖C(jī)制，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紫花苜蓿根頸芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得大量與抗寒相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。克隆鈣信號(hào)相關(guān)的MsNCX和MsCML抗寒基因，并分析這兩個(gè)基因在植物抵御非生物脅迫方面的功能。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析紫花苜?？购?/p>

2、機(jī)制
　　利用Illumina平臺(tái)對(duì)紫花苜蓿根頸芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得與抗寒相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化。獲得響應(yīng)冷凍脅迫的差異表達(dá)基因共5605個(gè)，其中1900個(gè)上調(diào)差異表達(dá)，3705個(gè)下調(diào)差異表達(dá)。GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要聚類在生物學(xué)過(guò)程的有機(jī)環(huán)狀化合物代謝過(guò)程，氧化還原過(guò)程和單一生物代謝過(guò)程;細(xì)胞成分的細(xì)胞壁，膜蛋白等;分子功能的核酸結(jié)合，結(jié)合和催化活性等子集中。差異表達(dá)基因主要是轉(zhuǎn)錄因子和各種信號(hào)傳導(dǎo)元件的關(guān)鍵基

3、因。350個(gè)差異表達(dá)基因被注釋為轉(zhuǎn)錄因子功能，屬于AP2/EREBP、Hsfs、MYB、bHLH、WRKY、NAC、bZIP和MADS等轉(zhuǎn)錄因子家族。鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑（如陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因和類鈣調(diào)素基因），植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑和蛋白泛素化途徑關(guān)鍵基因被富集，呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)。參與代謝途徑的基因也被富集，呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。
　　差異表達(dá)基因表達(dá)模式分析結(jié)果表明，編碼功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的差異表達(dá)基因在紫花苜蓿冷適應(yīng)和冷凍脅迫時(shí)期均上調(diào)表達(dá)，編碼調(diào)

4、節(jié)蛋白的差異表達(dá)基因在休眠期基因表達(dá)量高于冷凍脅迫時(shí)期。與冷凍脅迫時(shí)期相比，不是所有的基因在返青時(shí)期會(huì)被誘導(dǎo)。qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相關(guān)性很高，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
　　通過(guò)qRT-PCR分析紫花苜蓿在連續(xù)兩年越冬期的基因表達(dá)模式，結(jié)果顯示，鈣信號(hào)和和抗氧化酶基因在紫花苜蓿連續(xù)兩年的越冬期基因表達(dá)模式相同，激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因在冷適應(yīng)和冷凍脅迫時(shí)期表達(dá)趨勢(shì)一致，返青期基因表達(dá)變化不同，說(shuō)明鈣信號(hào)相關(guān)基因

5、在紫花苜?？购^(guò)程中起到重要作用。
　　2.紫花苜蓿MsNCX基因克隆和功能研究
　　克隆獲得紫花苜蓿MsNCX基因，該基因具有一對(duì)Na+/Ca2+結(jié)構(gòu)域，編碼597個(gè)氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsNCX蛋白與蒺藜苜蓿MtCAX蛋白同源。MsNCX基因在紫花苜蓿根，莖，葉中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高;低溫脅迫下，MsNCX基因在紫花苜蓿葉片中快速響應(yīng);根中MsNCX基因響應(yīng)鹽脅迫最劇烈;在干旱和鹽堿脅迫下，根中MsNCX基因在脅

6、迫6h表達(dá)量達(dá)到最高;根中MsNCX基因在ABA脅迫12h表達(dá)量達(dá)到最高。
　　構(gòu)建pCBM-MsNCX植物表達(dá)載體，并對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)草丁膦篩選，PCR和qRT-PCR檢測(cè)，選取表達(dá)量較高的4個(gè)株系用于后續(xù)功能分析。過(guò)表達(dá)MsNCX煙草的抗寒性顯著提高，表現(xiàn)為存活率較高，冷脅迫后MDA較低，抗氧化酶活性提高，積累較多的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖。與野生型相比，在鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量降低較慢，超氧陰離

7、子和過(guò)氧化氫含量較低;CAT酶活性顯著提高，同時(shí)積累較多的滲透保護(hù)性物質(zhì)，尤其是脯氨酸。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系葉片中積累較低的Na+含量，較高的K+含量。轉(zhuǎn)基因株系中脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量顯著高于野生型，說(shuō)明MsNCX基因可提高煙草抵御非生物脅迫的能力。
　　3.紫花苜蓿MsCML基因克隆和功能研究
　　克隆獲得紫花苜蓿MsCML基因，含有一個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，編碼196個(gè)氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsCML蛋白與鷹嘴豆CaCML

8、45蛋白親緣關(guān)系最近。MsCML基因在紫花苜蓿在莖中表達(dá)量最高，其次是根，表達(dá)量最少的是葉片。紫花苜蓿葉片中MsCML基因快速響應(yīng)不同的非生物脅迫，結(jié)果如下，在冷和鹽脅迫1h后MsCML基因表達(dá)量劇烈升高;在鹽堿和ABA脅迫下，MsCML基因在脅迫3h表達(dá)量達(dá)到最大值;在甘露醇脅迫下，MsCML基因在脅迫24h表達(dá)量達(dá)到最大值，說(shuō)明紫花苜蓿MsCML基因?qū)Ψ巧锩{迫的早期應(yīng)答過(guò)程起到重要作用。
　　構(gòu)建過(guò)表達(dá)植物表達(dá)載體pCBM-

9、MsCML，并對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)草丁膦篩選，PCR和qRT-PCR檢測(cè)，選取表達(dá)量較高的3個(gè)株系用于后續(xù)功能分析。過(guò)表達(dá)MsCML煙草的抗寒性顯著提高，可以快速恢復(fù)冷脅迫造成的損傷，與野生型相比，經(jīng)冷脅迫后葉片電導(dǎo)率和MDA較低，抗氧化酶活性提高，積累較多的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)。在鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系比野生型具有更高的葉綠素含量，超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量較低;抗氧化酶系活性提高，同時(shí)積累較多的脯氨酸減少非生物脅迫帶來(lái)的損