1、乙酰膽堿酯酶(EC3.1.1.7,AChE),是中樞神經系統(tǒng)的關鍵酶,它的主要功能是在神經突觸處通過催化水解神經遞質乙酰膽堿(Ach),調節(jié)Ach的水平從而終止神經沖動。AChE是由AChE基因(ace)編碼的,它是有機磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)類農藥的主要作用靶標。人們已經從數十種脊椎動物和無脊椎動物中克隆了AChE的編碼序列。大多數昆蟲的AChE是由兩種AChE基因(ace)編碼的。盡管在基因克隆方面做了大量的工作,但對兩種AC

2、hE功能的研究較少,兩種AChE的具體生物學作用仍不明確。本論文主要做了如下研究:
　　 1、不同蠶品種的兩種類型ace多態(tài)性及對農藥的敏感性研究
　　 中國有1000多種家蠶品種種質資源,而且家蠶受到的農藥污染相對較少,這為ace多樣性研究提供了好的材料。本研究測定了有代表性的24個品種家蠶對農藥毒死蜱和殘殺威的生物活性,比較了這24個品種家蠶AChE的比活力;克隆了31個品種家蠶兩種AChE的全長cDNA序列,對其氨

3、基酸序列進行了突變位點分析,并對31品種家蠶的核苷酸序列進行了進化分析。農藥生物活性測定結果表明,不同家蠶品種對不同的農藥具有不同的敏感性;純化的家蠶AChE的比活力分析表明,不同品種家蠶的AChE具有不同的比活力,酶的比活力和農藥敏感性沒有直接的相關性。對31個品種家蠶的氨基酸突變位點進行序列聯(lián)配分析發(fā)現,已克隆測序的31個1型ace ORF中有63氨基酸點突變,而已克隆的31個2型ace中僅有13個氨基酸點突變,由此可知家蠶2型ac

4、e相對保守。根據不同品種家蠶的核苷酸序列構建了兩種AChE的進化樹,結果表明,兩種AChE在進化關系上是獨立發(fā)生的。
　　 2、蠶兩種ace在不同發(fā)育階段的差異表達及RNAi干擾研究
　　 通過實時熒光定量PCR技術,分析了家蠶蠶卵和幼蟲不同發(fā)育時期兩種AChE mRNA表達水平的變化;通過RNAi技術,研究了喂食兩種AChE dsRNA對家蠶AChE mRNA表達水平的影響。結果表明,在卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲

5、時期,家蠶的2型AChE的表達水平明顯高于1型AChE,而在4齡和5齡幼蟲中,兩種AChE的表達水平相似;在幼蟲期,兩種AChE的表達水平呈下降趨勢。RNAi研究表明,給家蠶幼蟲喂食兩種類型AChE基因的dsRNA都能使家蠶幼蟲的發(fā)育延遲,最終導致家蠶死亡。Realtime PCR分析表明,RNAi降低了兩種類型AChE mRNA的表達水平。
　　 3、蠶兩種ace克隆及其編碼蛋白的催化特性和抑制動力學比較
　　 在我們

6、已經克隆和表達家蠶兩種類型的ace基礎上,本研究進一步克隆了家蠶的祖先--野蠶的兩種類型的ace的全長cDNA序列;在昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)中高效表達了這兩種ACHE;比較了這兩種AChE的催化特性以及兩種AChE對OP和CB類殺蟲劑的敏感性。兩種AChE的底物專一性和對選擇性抑制劑的敏感性分析表明,兩種重組AChE均具有高度的專一性和較高效的催化活性。酶動力學分析表明,1型AChE對ATC、BTC、和PTC的水解速率(Vmax)分

7、別是2型AChE的2.78、8.27、1.3倍。殺蟲劑抑制動力學分析表明,在9種OP和CB類農藥中,1型AChE對其中8種更敏感,但2型對其中的庚烯磷農藥更敏感。通過序列聯(lián)配分析表明,這些敏感性的差異可能是由于兩種酶的周邊位點差異引起的。兩種AChE的酶學和抑制劑敏感性差異為設計新型的選擇性農藥的提供了理論基礎。
　　 4、蠶追寄蠅ace的克隆,抗性相關點突變分析及其與宿主蠶2種AChE抑制動力學比較
　　 追寄蠅Exo

8、rista sorbillans(Diptera:Tachinidae)是家蠶的重要寄生害蟲,給蠶業(yè)造成很大損失。滅蠶蠅是一種用來防治家蠶寄生蠅的OP農藥,其選擇性殺滅追寄蠅機理仍不明確。由于長期使用,滅蠶蠅等農藥已經出現抗性問題,其抗性機制也有待解明。本研究首次克隆并表達了家蠶追寄蠅的ace,發(fā)現了一個與抗性相關的點突變(Gly353Ala,對應酶分別縮寫為Es-353G-AChE和Es-353A-AChE)。本研究將Es-353G-

9、AChE和Es-353A-AChE基因在昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)中進行了高效表達,通過對Es-353G-AChE和Es-353A-AChE的抑制動力學進行比較,確認該位點的突變與農藥的敏感性性有關。同時,將表達的追寄蠅的AChE與其宿主(家蠶)的兩種類型AChE進行抑制動力學比較發(fā)現,追寄蠅的AChE對農藥更敏感,這為OP農藥的選擇性殺滅寄生蠅機理提供了一種深入的解釋。
　　 5、利用生物反應器大量表達AChE研究
　　

10、 通常,農藥檢測是依托GC,LC,GC-MS或者LC-MS等技術建立起來的,其靈敏度較高,但耗費時間長、樣品準備復雜、需要專業(yè)的儀器支持,因此開發(fā)一種快速、高效、成本低的檢測方法實屬必要。本研究克隆了家蠅敏感品系的AChE基因,利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)高效表達了該基因;運用生物反應器,建立了規(guī)模表達的方法;通過過硫酸銨沉淀,親和層析的方法對表達的蛋白進行純化,從1L表達產物中獲得了4.2mg重組蛋白,該重組蛋白的酶活力為118.9