1、非禾草內(nèi)生麥角菌(non-clavicipitaceous grass endophytes)具有高度遺傳多樣性和功能多樣性,已經(jīng)成為當前菌物學(xué)研究的熱點和主題。挖掘內(nèi)生真菌資源對研究高等真菌生態(tài)學(xué)、進化機制等基礎(chǔ)理論和應(yīng)用開發(fā)均有重要的科學(xué)意義。從珍稀瀕危植物或具有特殊進化歷程、生存策略的植物中分離內(nèi)生真菌極有可能獲得種類新穎、功能特殊的宿主專一性類群。本篇論文對分布在云南西雙版納的瀕臨滅絕的禾本科植物--疣粒野生稻(Oryza gr

2、anulata)的內(nèi)生真菌資源進行了“生物勘探”。結(jié)合分離培養(yǎng)方法和免培方法,從形態(tài)水平(顯微觀察)、宏觀生態(tài)水平(多樣性參數(shù)計算和物種累加曲線預(yù)測)、生理水平(活體接種和活性測試)和分子水平(系統(tǒng)發(fā)育分析和環(huán)境PCR)等不同層次對疣粒野生稻內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)組成、多樣性特征、重要類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和部分菌株的生物學(xué)功能進行了分析。在2007-2009年9月份,分別進行三次野外調(diào)查,共采集樣品40株。
　　 主要結(jié)果:
　

3、　 1)組織染色法證實了內(nèi)生真菌菌絲在葉片和根系組織的分布,胞間或胞內(nèi)定殖:根系中存在多種真菌侵染結(jié)構(gòu)特征:“微菌核”(microsclerotia)可以充滿單個皮層細胞或零星分布在多個細胞中,同時有大量暗色有隔菌絲平行分布在皮層細胞,這些特征表明了暗色有隔內(nèi)生菌的存在(dark septate endophytes,DSEs);有些菌絲頂端細胞往往膨大、突起,形成不規(guī)則的類似附著孢的結(jié)構(gòu);此外還能觀察到類似厚垣孢子的聚集。但是,并沒

4、有觀察到典型菌根真菌的侵染結(jié)構(gòu)。
　　 2)通過分離培養(yǎng),共獲得根系內(nèi)生真菌菌株107株,莖桿74株和葉片組織78株(包括葉鞘)。利用經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類特征、“形態(tài)型”劃分和分子生物學(xué)方法對菌株進行鑒定。結(jié)果表明,葉片組織內(nèi)生真菌侵染頻率相對較高(48.1％),其優(yōu)勢種群是炭角菌(Xylariaceae)和節(jié)菱孢霉(Arthrinium spp.);而根系和莖桿組織內(nèi)生真菌侵染頻率較低(分別為15.7％和11.7％)且沒有明顯的優(yōu)勢

5、種群,絕大多數(shù)是單個種(singleton)。部分菌株在PDA或MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2周可產(chǎn)生無性態(tài)繁殖結(jié)構(gòu),包括Penicillium、Aspergillus、Cylindrocarpon、Fusarium、Phomopsis、Colletotrichum和Paecilomyces等;不產(chǎn)孢的菌株根據(jù)培養(yǎng)性狀劃分為多個“形態(tài)型”,然后對代表性菌株進行ITS序列測定,通過序列比對在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得最佳匹配記錄,大致確定分類地位

6、(目、科或?qū)俚乃?。BLAST結(jié)果表明很多菌株(尤其是莖內(nèi)生菌)的ITS序列與已知菌物序列的相似度較低(83％-94％),可能代表了潛在的新種或更高的分類單元。
　　 從分類地位看,絕大多數(shù)菌株屬于子囊菌門中的座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)。根、莖和葉片組織內(nèi)生真菌組成有明顯差別,其中根系內(nèi)生菌主要有座囊菌綱和散囊菌綱組成;莖內(nèi)生

7、菌主要由座囊菌綱和糞殼菌綱組成;而葉片內(nèi)生菌主要由糞殼菌綱組成。此外也分離到4株擔子菌,其中3株屬于無致病性的雙核絲核菌(Binucleate Rhizoctonia sp,有性階段為Ceratobasidium)和1株小皮傘屬(Marasmius)真菌。格孢腔目(Pleosporales)、巨座殼科(Magnaporthaceae)和節(jié)菱孢霉(Arthrinium)真菌在不同組織中均有分布而且基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析也揭示了其種類豐富

8、的特點。同時,野生稻內(nèi)生真菌種群的年度變化很大,僅有少數(shù)種類重疊。
　　 3)利用環(huán)境PCR方法,提取根系總基因組DNA,利用真菌特異性引物ITS1F和ITS4擴增真菌ITS片段,進而建立ITS基因克隆庫。最終獲得186個陽性克隆(無嵌合體結(jié)構(gòu))的序列,以90％相似度為分類單元界限,可以分為35個系統(tǒng)發(fā)育型(phylotypes)。檢測頻率最高的克隆屬于未知的擔子菌(25.1％),而且60.2％的克隆序列最佳BLAST結(jié)果均與分

9、類地位尚不明確的記錄匹配。
　　 4)從根系中分離到兩株巨座殼科真菌,通過比較產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子、培養(yǎng)性狀等形態(tài)特征,并分析ITS系統(tǒng)發(fā)育樹,將其定名為一新種--稻鐮狀瓶霉(Harpophoraoryzae Z.L.Yuan,C.L.Zhang& F.C.Lin,sp.nov.)。在1/2MS培養(yǎng)上,接種Harpophoraoryzae可以顯著促進栽培水稻的生長并提高其生物量,組織染色觀察也證明H.oryzae能成功定殖在根系皮

10、層細胞中。
　　 5)從莖桿中分離到兩種Muscodor屬(炭角菌科)真菌,這是首次在我國發(fā)現(xiàn)該屬真菌。ITS、RPB2基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明,S13-1-2菌株與已報道的模式種M.albus(白色產(chǎn)氣霉)序列100％相似;S18-3-1菌株的ITS序列與M.yucatanPnsis相似性有98％,但RPB2序列與M.albus的差異高達17％;而且在菌落特征、生長速度等方面與M.yucatanensis也有明顯差別,因

11、此將其定名為一新種--云南產(chǎn)氣霉(Muscodoryunnanense Z.L.Yuan,C.L.Zhang& F.C.Lin,anam.sp.nov.)體外抑菌試驗表明,M.albus S13-1-2和M.yunnanense S18-3-1能產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì),對多種植物病原真菌的生長有強烈的抑制效果,甚至是致死作用。M.yunnane S18-3-1的活性比M.albus S13-1-2更強。
　　 6)生物學(xué)功能初步分析

12、表明,內(nèi)生雙核絲核菌R15-3-1預(yù)處理栽培水稻幼苗可以提高水稻對紋枯病菌(Rhizoctonia solani)的抗病能力。
　　 結(jié)論：概括與科學(xué)意義:
　　 1)疣粒野生稻根系和莖桿組織內(nèi)生真菌多樣性極其豐富。Exophiala、Cladophialophora、Periconia macrospinosa和Rhizoctonia等代表了根系潛在的DSEs,但需要進一步的試驗證據(jù)證明:Harpophora oryz

13、ae可以作為栽培水稻根系的DSE;疣粒野生稻的內(nèi)生真菌的遺傳多樣性比已報道的栽培稻品種要豐富,表明在原產(chǎn)地野生狀態(tài)下的植物可能蘊含物種更豐富、更新穎的功能性菌株。
　　 2)根系染色觀察和PCR方法均未檢測到菌根真菌的存在,至少說明在某些特定生境下,內(nèi)生真菌扮演著與菌根真菌同等重要的角色。
　　 3)格孢腔內(nèi)生真菌在草本植物中(也包括禾本科植物)較常見:巨座殼和節(jié)菱孢霉在禾本科植物中更為普遍,顯示內(nèi)生真菌在種類組成具有一

14、定的宿主特異性(至少在植物“科”的水平上)。而且其中一部分菌株很可能代表了新的分類地位,這對于相關(guān)類群的進化生物學(xué)與整體系統(tǒng)生物學(xué)研究具有重要的參考價值。
　　 4)“單個種”或稀有種在根系和莖桿組織中較為常見,這些種類并非是由于樣品數(shù)量、隨機侵染宿主或操作污染造成的,而是嚴格意義上的“真正內(nèi)生菌”(trueendophytes),與宿主經(jīng)歷了長期的協(xié)同進化(不具有強致病性),因此在分析內(nèi)生真菌生物多樣性或功能多樣性時,不應(yīng)該將

15、這些種類剔除或忽略。
　　 5)內(nèi)生真菌種群具有明顯的年度變化,因此在系統(tǒng)挖掘某一類植物內(nèi)生真菌資源時,在不同年份、不同生長季節(jié)分別取樣有可能獲得更豐富的內(nèi)生真菌類群,從而有助于更清晰認識植物內(nèi)生真菌的一系列基礎(chǔ)生物學(xué)特性。
　　 6)環(huán)境PCR方法通常能檢測到更多的擔子菌,而培養(yǎng)方法獲得的菌株絕大多數(shù)屬于子囊菌。因此常規(guī)分離培養(yǎng)方法獲得的類群并不能反映植物內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的真正面貌,可以嘗試采用不同的分離方法、培養(yǎng)技術(shù)