1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病。該病自發(fā)現(xiàn)以來給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年來我國大部分地區(qū)夏秋季出現(xiàn)豬的高熱病，農(nóng)業(yè)部2007年確

2、定引起高熱病的主要病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株。GP5蛋白是PRRSV主要囊膜蛋白之一，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要保護(hù)性抗原蛋白。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定功能，病毒囊膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作。PRRSV-GP5拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的研究，對(duì)深入了解PRRSV與宿主細(xì)胞相互作用，研制高效PRRS疫苗都具有積極意義。
　　 本文針對(duì)高致病性PRRSV(江西a1)，從四個(gè)方面對(duì)GP5蛋白進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究，獲得了初步的研究結(jié)果。
　

3、　 一、GP5蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測
　　 通過hmmtop、TMHMM-2.0、MemBrain和DAS等軟件分析，GP5蛋白共有三個(gè)主要集中疏水片段，分別是Aa8-27、Aa63-82和Aa107-126。推測這三段可能是跨膜片段，GP51-33Aa為信號(hào)肽，翻譯后發(fā)生剪切，推測為后兩段為跨膜片段，AB表位和C末端是GP5蛋白的兩個(gè)重要抗原表位區(qū)，所以推測30-62位于病毒囊膜的外側(cè)，83-106位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)，而127以后位

4、于囊膜的內(nèi)側(cè)。
　　 二、GP5蛋白親水區(qū)特異性抗體制備
　　 根據(jù)以上預(yù)測結(jié)果，分別化學(xué)合成GP5蛋白的四個(gè)親水區(qū)肽段：MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVC(Aa1-27，編號(hào)為IL36)、VLVN ASNNNSSHIQLIYNLC(Aa27-45，編號(hào)IG45)、TTSHFLDTVGLATVST AGYYHGRYC(Aa83-106，編號(hào)為IY45)和TPLTRVSAELWGRL(Aa187-20

5、0，編號(hào)為IL-35)。將合成肽用白油佐劑乳化后，免疫ICR小白鼠，ELISA檢測血清效價(jià)并驗(yàn)證特異性，最后采血分離血清備用。
　　 三、免疫學(xué)方法研究GP5蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)
　　 應(yīng)用免疫學(xué)方法研究GP5蛋白在細(xì)胞中和病毒粒子中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。將PRRSV接種Marc-145細(xì)胞，細(xì)胞固定后，利用不同去垢劑處理(Tritonx-100和digitonin)，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示AB表位和C末端兩個(gè)重要抗原表位區(qū)位于細(xì)

6、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的內(nèi)側(cè)(lumen)，即病毒囊膜的外側(cè)。通過超離純化病毒粒子后，使用蛋白酶k水解，進(jìn)行的western-blotting試驗(yàn)，結(jié)果也表明，AB表位和C端也位于病毒囊膜的外側(cè)，與預(yù)測結(jié)果相符合。
　　 (四)融合蛋白法研究GP5蛋白膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)
　　 應(yīng)用融合蛋白方法，將禽流感血凝素標(biāo)簽與GP5融合研究GP5膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。利用重疊延伸PCR技術(shù)將HA標(biāo)簽(YPYDVPDYA)分別插入到GP5的N端、50位、95位和C