1、輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotaviras)成員，作為嬰幼兒和動物腹瀉的主要病原在世界范圍內(nèi)廣泛流行，特別是在發(fā)展中國家每年造成巨大損失。鑒于其危害嚴重且無有效治療手段，世界衛(wèi)生組織將RV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更為重要。隨著分子生物學的深入研究，現(xiàn)已證明VP4蛋白是RV的外衣殼蛋白，介導病毒的吸附和穿入，使病毒具有致病性；VP4還是

2、一種中和抗原，其中和抗原位于保守的VP4抗原表位區(qū)，自然感染時能刺激機體產(chǎn)生中和抗體。 本實驗選擇乳酸菌作為受體菌株表達外源基因Vp4，即可將乳酸菌的益生功能和外源基因的特異性免疫相結合，從而研制豬輪狀病毒Vp4基因工程乳酸菌。目的在于為開發(fā)研制預防豬輪狀病毒病的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基礎。 本研究采用現(xiàn)代分子生物學技術以SalI和KpnI雙酶切克隆質(zhì)粒pGEM-T-Vp4和以胸苷酸合成酶基因(Thymidylate

3、 synthase,ThyA)及紅霉素基因(Erythromycin)為選擇壓力的雙標記的可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達的質(zhì)粒載體pW425et，構建出可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達的原核表達重組質(zhì)粒pW425et-vp4。經(jīng)篩選表達的陽性重組質(zhì)粒應用電穿孔轉(zhuǎn)化實驗轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌受體菌株中，篩選表達的陽性重組乳酸菌大量培養(yǎng)，離心加入滅菌脫脂乳液給BALB/c小鼠口服，應用ELISA方法檢測血清抗體水平，應用小鼠sIgA試劑盒檢