1、植物抗病性是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。植物抗性調(diào)控基因的克隆和功能分析有利于深入了解植物抗病性的分子機(jī)理。天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS)(EC6.3.5.4)通常由一個(gè)小的基因家族所編碼。該酶為廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)的一類氨基轉(zhuǎn)移酶，以氨或谷氨酰胺以及天冬氨酸為底物催化天冬酰胺的生物合成。它能增強(qiáng)氮從源組織到庫(kù)組織的重新定位，通過(guò)調(diào)節(jié)氮代謝參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控。然而AS對(duì)植物抗病性的調(diào)控功能尚不明

2、確。本研究擬分別克隆番茄和水稻AS基因，并采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced genesilencing，VIGS)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)和RNAi技術(shù)，研究AS基因?qū)χ参锟共⌒缘恼{(diào)控功能。獲得如下結(jié)果：
　　 1番茄和水稻天冬酰胺合成酶基因的克?。焊鶕?jù)已知的核苷酸序列，設(shè)計(jì)番茄和水稻共四對(duì)引物，分別以番茄和水稻的cDNA為模板，采用RT-PCR法克隆獲得獲得長(zhǎng)度為1680bp的S1AS1、長(zhǎng)度分別為1776bp、

3、1815bp、1512bp的OsAS1、OsAS3和OsAS4全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 2天冬酰胺合成酶基因的抗病功能分析：采用VIGS技術(shù)和瞬時(shí)超表達(dá)分析了AS基因?qū)Ψ押捅臼蠠熆共〉恼{(diào)控功能。發(fā)現(xiàn)S1AS1基因在番茄沉默植株產(chǎn)生的Cf4/Avr4介導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)癥狀比對(duì)照顯著減輕甚至完全喪失。表明SIAS1基因可能對(duì)Cf4/Avr4介導(dǎo)的HR起重要調(diào)控作用。另外，N

4、bAS(即b48)在本氏煙沉默植株產(chǎn)生的稻白葉枯菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)介導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)敏性反應(yīng)癥狀比對(duì)照減輕，而瞬時(shí)超表達(dá)植株產(chǎn)生的Xoo介導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)敏性反應(yīng)癥狀比對(duì)照則增強(qiáng)。說(shuō)明AS是植物對(duì)Xoo的非寄主抗性的重要調(diào)控因子。
　　 3番茄和水稻的過(guò)量表達(dá)和RNAi結(jié)構(gòu)的構(gòu)建：根據(jù)番茄和水稻分別是雙子葉和單子葉植物的特性，對(duì)番茄AS基因的表達(dá)選用35S啟動(dòng)子控制；對(duì)水稻AS基因的表達(dá)則選

5、用玉米Ubi啟動(dòng)子控制。因此，選用具有卡那霉素抗性植物雙元表達(dá)載體pCHF3和潮霉素抗性植物雙元表達(dá)載體pC1301-35S、pCZD、pANDA，構(gòu)建了適用于番茄的SIAS基因過(guò)量表達(dá)和RNAi結(jié)構(gòu)pCHF3-S1AS1和pC1301-35S-S1AS1，以及適用于水稻的OsAS基因過(guò)量表達(dá)和RNAi的結(jié)構(gòu)pCZD-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS(水稻AS基因家族沉默結(jié)構(gòu))。用電擊法將含有AS

6、基因的超表達(dá)和RNAi結(jié)構(gòu)分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用于番茄和水稻的轉(zhuǎn)化。
　　 4轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得：將含OsAS基因過(guò)量表達(dá)和RNAi結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織共培養(yǎng)。經(jīng)潮霉素抗性篩選共獲得89個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因單株，分別獲得轉(zhuǎn)過(guò)量表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsAS1、3、4的再生單株28個(gè)、11個(gè)和14個(gè)；獲得轉(zhuǎn)RNAi沉默結(jié)構(gòu)pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS的再生單株7個(gè)、12個(gè)、14個(gè)和