1、金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌，在乳腺中主要以生物被膜的形式存在。研究金黃色葡萄球菌生物被膜的形成能力和相關(guān)效應因子，對于我們在臨床治療中篩選針對生物被膜的藥物和研究抑制生物被膜形成的抗原表位疫苗具有十分重要的意義。本實驗針對金黃色葡萄球菌生物被膜進行如下研究:
　　1.奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相關(guān)基因分析
　　利用硅膠片法培養(yǎng)葡萄球菌生物被膜，經(jīng)充分洗滌后對生物被膜進行銀染定性判斷菌株形成生物被膜的能力，通

2、過生物被膜菌落結(jié)晶紫染色法定量檢測菌株生物被膜的形成能力，并用掃描電鏡觀察被膜結(jié)構(gòu)。銀染法定性結(jié)果顯示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可見的生物被膜，生物被膜形成率為87.6％；結(jié)晶紫染色定量檢測與硅膠粘附的有132株，不粘附的有5株。對葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB基因進行PCR擴增檢測。實驗所用的137株葡萄球菌中，57株能擴增出bap基因；有43

3、株和54株分別能擴增出icaAD和icaBC；有73株、49株和38株分別擴增出sigB、sar和agr；分別有76株和50株染色體中存在clfaA和clfaB；fnbpA和fnbpB分別在52株和26株菌株中擴增出。推測bap、sigB、sar、icaAD和icaBC基因是生物被膜形成的重要相關(guān)基因；agr及粘附素基因clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB對生物被膜形成的作用不明顯。
　　2.抗生素對生物被膜的影響

4、>　　采用硅膠片24孔板法培養(yǎng)e9和e25株生物被膜，初始培養(yǎng)時每孔分別加入1ml含有1/16MIC抗生素的TSB，每12小時用含抗生素的TSB換液，37℃連續(xù)培養(yǎng)3天，采用結(jié)晶紫染色，測定492nm處的光密度值。發(fā)現(xiàn)對于生物被膜強株e9，頭孢吡肟有明顯的抑制作用，Amp、Met對生物被膜的形成沒有抑制作用，生物被膜的形成反而增強；而對于生物弱株e25，Amp和頭孢吡肟對其生物被膜的形成幾乎沒有抑制作用，Met有抑制作用，與空白對照組相

5、比差異極顯著。
　　分別取實驗菌株培養(yǎng)3天和7天的生物被膜，放入含各種抗生素的TSB的24孔板37℃培養(yǎng)1天，每12小時用含抗生素的TSB換液，結(jié)晶紫染色后測492nm的OD值。對于生物被膜強株e9，除了低濃度(1/16MIC)的頭孢吡肟，其他濃度的抗生素都對其3天生物被膜有抑制作用，10倍MIC的Amp和頭孢吡肟抑制效果顯著(P＜0.05)。除了MIC濃度的Amp，其他濃度的抗生素都對7天成熟生物被膜有抑制作用，抗生素濃度越大作

6、用越明顯。對于生物被膜弱株e25，1/16MIC的Amp對3天生物被膜幾乎沒有抑制作用，其他濃度的抗生素都有抑制作用，但不顯著。而MIC的Amp對7天生物被膜有很微弱的抑制作用，10倍和20倍MIC抗生素濃度有抑制作用；三種濃度的Met和頭孢吡肟對7天生物被膜都有抑制作用，20倍MIC的Met和頭孢吡肟與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明:高濃度比低濃度的Amp、Met、頭孢吡肟對生物被膜有較好的抑制作用，相同濃度的抗生素對

7、未成熟生物被膜有較好的抑制作用。低濃度的Amp、Met對生物被膜幾乎沒有抑制作用，反而有利于刺激促進生物被膜的形成，生物被膜形成能力越強的菌株，這種促進作用越明顯。
　　3.構(gòu)建奶牛乳腺T7噬菌體展示cDNA文庫
　　使用Straight A’sTM mRNA Isolation System的Magnetight Oligo(dT) Particles分離純化奶牛乳腺mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)過末端修