1、黑麥草是世界范圍內(nèi)廣泛種植的冷季型牧草和草坪草。一年生黑麥草(Lolium multiflorum Lam.)和多年生黑麥草(Lolium perenne L.)是兩個重要的黑麥草栽培種。由于黑麥草高度自交不親和，通過傳統(tǒng)育種方法進行遺傳改良復雜而困難?；蚬こ碳夹g的發(fā)展和應用，打破了物種間基因流動的限制，能將外源基因導入改良植物特定的性狀。目前，全球水資源短缺問題日益嚴峻，干旱嚴重影響作物產(chǎn)量，而黑麥草耐旱能力弱。因此提高抗旱性是黑麥

2、草育種的主要目標之一，利用生物技術培育黑麥草抗旱新品種具有重要的經(jīng)濟意義和科學意義。
　　 甘氨酸甜菜堿(簡稱甜菜堿)在增強植物抗旱性中有重要作用，通過基因工程途徑提高細胞甜菜堿含量改善植物抗逆性的研究已有較多工作。甜菜堿可通過膽堿氧化途徑和甘氨酸連續(xù)甲基化途徑合成，其中前一途徑研究較早，一些參與該途徑的酶基因已被克隆并應用于植物抗逆基因工程研究。后一途徑近年才發(fā)現(xiàn)，目前有關參與該途徑的酶基因克隆及利用的工作報道很少。以甘氨酸為

3、底物合成甜菜堿，由于甘氨酸在細胞內(nèi)濃度較高，甜菜堿的大量積累受限較少，因此克隆相關基因的工作受到關注。本論文首先從藍細菌嗜鹽隱桿藻GR02中克隆得到兩個甲基化酶基因ApGSMT2和ApDMT2，它們在轉基因大腸桿菌和轉基因煙草中能夠有效催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。然后將它們插入單子葉植物表達載體中，通過農(nóng)桿菌介導的黑麥草從生芽塊遺傳轉化方法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉入一年生黑麥草和多年生黑麥草中，獲得了穩(wěn)定的轉基因株系，進而開

4、展轉基因黑麥草抗旱特性的研究，較深入揭示了轉基因黑麥草抗旱性提高的機理。ApGSMT2和ApDMT2基因的克隆和功能確定根據(jù)已報道的嗜鹽隱桿藻來源的甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶基因(ApGSMT)和二甲基甘氨酸甲基轉移酶基因(ApDMT)序列設計PCR引物，我們從南京大學分離的嗜鹽隱桿藻GR02中克隆出兩個DNA片段，分別長798 bp和834 bp，各自包含一個開放閱讀框(ORF)。利用生物信息學方法對這兩條DNA片段進行序列分析和編碼產(chǎn)物

5、的結構預測，發(fā)現(xiàn)它們與各種來源的轉甲基酶序列相似性較高，它們可能分別編碼甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶和二甲基甘氨酸甲基轉移酶。將這兩條DNA片段分別命名為ApGSMT2和ApDMT2。與已報道的ApGSMT和ApDMT基因相比，ApGSMT2和ApDMT2基因與它們在核苷酸水平上序列相似性分別為83％和84％，氨基酸序列相似性分別達93％和91％。與其它物種的轉甲基酶相比，在氨基酸水平上，ApGSMT2與EcGSMT(來源于Ectothior

6、hodospirahalochloris，一種厭氧光合硫細菌)為64％，與AcGSDMT(來源于Actinopolysporahalophila，一種需氧異養(yǎng)真細菌)為64％；ApDMT2與EcSDMT為50％，與AcGSDMT為48％。在ApGSMT2和ApDMT2基因編碼的氨基酸序列中，存在保守的AdoMet(腺苷甲硫氨酸)結合基序：MotifⅠ，PostⅠ，MotifⅡ和MotifⅢ。蛋白結構預測得出ApGSMT2和ApDMT2各

7、具有一個由7個β-折疊片構成的“AdoMet-dependent MTase fold(AdoMet依賴的甲基轉移酶折疊)”結構，且這7個β-折疊片是按照(6↓7↑5↓4↓1↓2↓3↓)順序排列。這個結構被認為是甲基轉移酶(Mtases)的特征結構。
　　 為了確定ApGSMT2和ApDMT2基因的功能，將它們共轉入E.coli和模式植物煙草中，檢測轉基因大腸桿菌和轉基因煙草中甜菜堿含量。在E.coli中共表達ApGSMT2和A

8、pDMT2基因導致甜菜堿的合成量增加，與未轉基因對照細胞相比，在正常培養(yǎng)條件下甜菜堿含量增加1倍左右。煙草自身不合成甜菜堿。表達ApGSMT2和ApDMT2基因的轉基因煙草(GSD株系)中能夠積累甜菜堿(可達0.4436μmol g-1FW)。與轉betA基因煙草(betA株系)相比，GSD株系的甜菜堿積累量是betA株系的4.3倍。betA基因編碼催化膽堿合成甜菜堿的酶。不同的甜菜堿積累量可能是兩種轉基因煙草合成甜菜堿的底物不同的緣故

9、，GSD株系以甘氨酸為底物，betA株系以膽堿為底物。游離甘氨酸在煙草細胞中含量豐富，而膽堿的含量比較低。在20％的PEG水溶液中，GSD株系種子萌發(fā)率高達65.2％，顯著高于betA株系(50.9％)。小苗干旱試驗也表明，GSD植株在干旱脅迫下的生長狀況遠遠好于轉betA株系的。生理指標檢測得出，與轉betA株系和野生型相比，干旱脅迫下GSD植株的相對含水量(RWC)較高，膜受損程度較輕，還能保持相對較高的凈光合速率和PSⅡ最大光化學

10、效率(Fv/Fm)。因而在GSD株系中，甜菜堿可能主要通過在干旱脅迫下維持細胞膜的完整性和穩(wěn)定PSⅡ中心復合體提高轉基因煙草的抗旱性，抗旱能力與甜菜堿的積累量正相關。
　　 在此部分工作中，我們克隆出ApGSMT2和ApDMT2基因，它們編碼的蛋白催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。對轉基因煙草進行抗旱性分析，得出GSD株系的甜菜堿積累量高于轉betA株系的，抗旱性也優(yōu)于轉betA株系的。這些結果表明ApGSMT2和ApDMT2基因在植

11、物抗逆基因工程研究中有很好的應用前景。轉ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的產(chǎn)生為了轉化單子葉植物黑麥草，將ApGSMT2和ApDMT2基因重組到一個單子葉植物表達載體質(zhì)粒上。在這個質(zhì)粒中，ApGSMT2和ApDMT2基因分別被玉米ubiquitin啟動子啟動轉錄。以抗除草劑草甘膦的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(Epsps)基因為植物轉化選擇標記。通過農(nóng)桿菌介導的從生芽塊轉化法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉入一年生黑麥

12、草和多年生黑麥草。通過除草劑篩選和PCR檢測選擇轉基因黑麥草植株，采用Southern雜交技術進‘步確定外源基因是否整合入黑麥草基因組中，利用反轉錄PCR技術確定外源基因在轉基因黑麥草中的表達。從黑麥草轉化植株中選出了一批穩(wěn)定的轉基因材料。轉ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的抗旱性分析分別以3個轉基因多年生黑麥草T0代無性系和3個來自不同轉化體的轉基因一年生黑麥草T2代株系為材料進行抗旱性分析。把轉基因多年生黑麥草和野生型(WT)

13、的大小基本一致分蘗移栽到土質(zhì)均一的花盆中，地上部分修剪成5 cm高，恢復生長4周后，停止供水進行干旱脅迫處理。對于轉基因一年生黑麥草T2代和WT的種子播種到花盆中，經(jīng)除草劑篩選和PCR檢測后，恢復生長一個月后進行干旱脅迫處理。
　　 在干旱處理過程中，WT比轉基因黑麥草植株萎蔫早，生長受抑制嚴重，而轉基因黑麥草植株根系更發(fā)達，萎蔫較晚，能夠積累更多的生物量。經(jīng)過長時間的干旱脅迫處理，所有的黑麥草株系葉片卷曲，嚴重失水；但復水后轉

14、基因黑麥草植株可以較快恢復生長，表現(xiàn)出較高的存活率。這些表型觀察的結果表明轉ApGSMT2和ApDMT2基因提高了黑麥草的抗旱能力。
　　 干旱處理前，轉基因多年生黑麥草和轉基因一年生黑麥草的甜菜堿含量分別為3.60～3.83μmol-1FW和2.19～2.31μmol g-1FW，與WT相比沒有明顯差異。干旱處理7天后，轉基因黑麥草和WT的甜菜堿積累量均大幅度升高，前者升高幅度更大。如轉基因多年生黑麥草L3的甜菜堿含量達17.

15、34μmol g-1FW，是WT7.91μmol g-1FW的2.19倍；轉基因一年生黑麥草L3的甜菜堿含量為6.12μmolg-1FW，是WT4.3μmol g-1FW的1.42倍。對轉ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的轉基因表達分析得出，干旱脅迫下甜菜堿的含量同轉基因表達量呈正相關，即轉基因黑麥草在干旱脅迫處理中的甜菜堿增加與轉基因表達強度相對應。
　　 測定轉基因黑麥草和WT在干旱處理過程中的生理指標，以探討轉基因黑

16、麥草抗旱性提高的可能機制。干旱處理過程中所有黑麥草株系的葉片RWC和凈光合速率(Pn)均下降，但轉基因黑麥草的葉片RWC和Pn的降低幅度顯著小于WT的，并且轉基因黑麥草的離子滲漏率和丙二醛(MDA)積累水平均低于WT，即轉基因黑麥草株系的葉片細胞膜受損程度較輕。這些結果表明轉基因黑麥草的甜菜堿含量增加有效地穩(wěn)定了細胞膜的完整性，這可能是葉片保持相塒較高RWC和Pn的原因之一。同WT相比，干旱脅迫過程中轉基因黑麥草株系能保持相對較高的Pn

17、，一部分歸因于輕微干旱下較高的氣孔導度(gS)能夠保證CO2供應，另一方面歸因于PSⅡ中心復合體在嚴重脅迫下受損較輕。干旱脅迫下轉基因黑麥草的Fv/Fm值高于WT，表明更多甜菜堿的積累可能也有效地保護PSⅡ中心復合體結構及功能。由于在干旱脅迫下轉基因黑麥草能保持較強的光合能力，因此葉片可積累較多的可溶性糖。
　　 高等植物中各氨基酸的合成途徑之間存在密切聯(lián)系，一種氨基酸量的變化有可能影響整個游離氨基酸庫?？紤]到轉基因黑麥草消耗甘

18、氨酸合成甜菜堿，有必要分析轉基因黑麥草中各游離氨基酸的水平。干旱處理前轉基因黑麥草和WT的各游離氨基酸含量沒有顯著差異。干旱處理7天，轉基因一年生黑麥草的Gly、Ser和Thr含量顯著低于WT的，而轉基因多年生黑麥草中僅有Gly顯著低于WT。這可能是因為轉基因黑麥草中，Gly被消耗合成甜菜堿，需較多的Ser用于Gly合成的結果。干旱脅迫下，植物能夠積累游離氨基酸，尤其是Pro作為滲透調(diào)節(jié)保護物質(zhì)。干旱脅迫后轉基因黑麥草和WT的游離氨基酸

19、總量和Pro含量均大幅度增加，但轉基因材料和WT之間沒有明顯差異，這表明同WT相比，轉基因黑麥草抗旱能力的提高與游離氨基酸總量和Pro含量變化無關。
　　 檢測轉基因多年生黑麥草中干旱脅迫相關基因的表達變化，探討引入新的甜菜堿合成途徑對其他基因表達的影響。選擇的基因有兩個DREB/CBF轉錄因子基因的同源基因、D1蛋白編碼基因、催化合成膽堿的磷酸膽堿胞苷酰轉移酶基因和AQPs基因等。AQPs是水通道蛋白，植物可以通過控制AQPs

20、活性來抵御干旱脅迫，比較分析4個多年生黑麥草的水通道蛋白基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)LpTIR2:1和LpTIR1:2基因的表達在轉基因植株和WT間有差異，黑麥草積累更多甜菜堿可能促進了它們的表達。但是多數(shù)基因的表達趨勢在轉基因株系和WT之間無明顯差別，即未受到轉基因的影響。
　　 在此部分研究中，通過轉ApGSMT2和ApDMT2基因，將甘氨酸甲基化合成甜菜堿途徑首次引入黑麥草中。異源表達ApGSMT2和ApDMT2基因增加了黑麥草中

21、甜菜堿的積累量，抗旱能力得到顯著提高。生理學和分子生物學分析表明干旱脅迫下在轉基因黑麥草中甜菜堿不僅能夠穩(wěn)定細胞膜的完整性和PSⅡ中心復合體，而且還可能影響一些脅迫相關基因的表達。
　　 綜上所述，本工作克降出編碼催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿的ApGSMT2和ApDMT2基因，通過轉基因植物證實了其應用價值，豐富了抗逆植物基因工程研究的基因資源。另外，獲得了抗旱性明顯提高的轉基因黑麥草材料，為我國黑麥草育種工作做出力所能及的貢獻；