1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)的病原菌。主要引起豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重經濟損失。根據APP莢膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同可將APP分為15個血清型，每個血清型的流行地區(qū)和毒力有所差別，我國主要流行1、2、3和7型。APP的主要毒力因子包括莢膜多糖

2、(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、轉鐵結合蛋白(Tbp)、RTX外毒素、粘附因子、尿酶、蛋白酶等。根據這些毒力因子的功能，研究人員開發(fā)了許多候選疫苗用來預防和控制該病。但用于臨床的主要是滅活苗和亞單位疫苗，其免疫保護力有限，不能提供對不同血清型的交叉保護作用，所以迫切需要開發(fā)新型疫苗來預防和控制該病。病原分子生物學與致病機理的研究是新型疫苗設計和開發(fā)的基礎，對APP感染過程相關基因進行研究是非常必要的。本課題構建了APP

3、血清JL-03型菌株的基因組表達文庫，制備了APP感染豬的康復血清，運用免疫學技術篩選到14個APP的體內誘導的抗原基因，并對部分體內誘導抗原基因進行了免疫原性研究。主要研究成果如下：
　　 APP基因組表達文庫的構建：提取APPJL-03型的基因組DNA，用Sau3AI酶切后回收0.5～2kb的片段，分別克隆到原核表達載體pET-28a/b/c中，轉化宿主菌，構建了基因組表達文庫。文庫大小分別為2.50×104cfu/μL、1

4、.91×104cfu/μL和2.12×104cfu/μL；文庫重組質粒含有率大于60％，可以進行篩選研究。
　　 血清抗體探針的制備：用非致死劑量5×105cfu攻毒豬只，收集康復血清，用硝酸纖維膜塑模分別吸附菌體抗原和分泌抗原，吸附4次后，ELISA檢測血清吸附效果（OD630由1.23下降到0.16），且第3次和第4次基本無變化，即得到抗體探針，可用于文庫篩選。分別地陽性重組質粒。
　　 體內誘導抗原的篩選：用IPT

5、G誘導表達文庫蛋白，用免疫印跡方法進行文庫篩選，篩選到11個克隆，對篩選到的陽性克隆測序，測得的序列用軟件BLAST進行同源性比對，確定開放閱讀框(ORF)，共包括14個ORF.
　　 體內誘導抗原免疫原性驗證：從14個ORF中選出3個在各血清型相對保守的基因，進行了克隆、表達、純化并對其免疫原性進行了驗證。將pkyA、purR3、mutT2三個基因克隆到表達載體pET-28a中，進行表達純化，通過Western-blot驗證，