1、為了探討陸地棉對(duì)黃萎病菌的抗性機(jī)理,本研究首先從河南商丘地區(qū)的棉花病株中分離并鑒定出了強(qiáng)致病力棉花黃萎病菌,進(jìn)而分析了陸地棉受黃萎病菌侵染后蛋白質(zhì)表達(dá)及保護(hù)酶系活性的變化,探討了棉花NBS抗病基因?qū)Σ≡目剐苑磻?yīng),構(gòu)建了棉花病毒誘導(dǎo)基因沉默體系。得出如下主要結(jié)果:
　　 1強(qiáng)致病力棉花黃萎病菌的收集、分離鑒定及致病型分析
　　 對(duì)商丘地區(qū)棉花上的8株單孢菌株,從菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、致病力、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal

2、 transcribed spacer,ITS)序列、系統(tǒng)進(jìn)化及菌體蛋白質(zhì)等方面進(jìn)行了分析。菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)及ITS序列分析表明,這些菌株屬于棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae;利用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示8株菌株并沒有聚在同一進(jìn)化枝上;致病力分析顯示8株黃萎病菌菌株存在致病力差異,SQ4菌株致病力最強(qiáng),屬于落葉型,而致病力最弱的SQ1菌株,屬于非落葉型;菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析表明,不同致病力的菌株間

3、蛋白質(zhì)譜帶存在差異。
　　 2陸地棉被強(qiáng)致病力菌株SQ4侵染后蛋白質(zhì)表達(dá)及保護(hù)酶系活性的變化
　　 分析了陸地棉被SQ4侵染前后PR蛋白質(zhì)的變化、活性氧及保護(hù)酶系在不同抗性品種中的差異。雙向電泳分析結(jié)果顯示,陸地棉品種中棉41植株被SQ4侵染后和對(duì)照間存在蛋白質(zhì)點(diǎn)的有無及表達(dá)量多少的差異;半定量分析發(fā)現(xiàn),在抗性品種和耐病品種中,幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶兩種酶的表達(dá)量明顯增加,表明這兩種酶與棉花對(duì)黃萎病的抗性反應(yīng)密切

4、相關(guān):但其它兩種PR蛋白質(zhì)(PR1和Ⅲ型幾丁質(zhì)酶)并未參與棉花黃萎病的抗性反應(yīng),說明不同的植病系統(tǒng)中參與抗性反應(yīng)的PR蛋白質(zhì)可能不同。對(duì)活性氧和保護(hù)酶系活性變化的研究表明,參與抗性反應(yīng)的保護(hù)酶體系存在差異。
　　 3棉花NBS抗病基因的發(fā)掘
　　 根據(jù)已克隆的R基因的保守序列設(shè)計(jì)引物,在棉花不同抗性品種中克隆出500bp左右大小的片段,測(cè)序并在NCBI上進(jìn)行Blast分析,發(fā)現(xiàn)這些序列除一個(gè)序列外都和已經(jīng)克隆的抗病基因類

5、似物(RGAs)的同源性高達(dá)98％以上;以克隆到的RGAs和植物中已經(jīng)克隆的幾個(gè)典型的R基因序列建立了進(jìn)化樹,可將棉花中的RGAs序列分別聚在三個(gè)不同的亞家族,但這些序列片段的功能需要通過后續(xù)的功能驗(yàn)證來確定。本研究還利用NBS-Profling技術(shù),從棉花中克隆出一個(gè)NADH基因片段,該基因和棉屬的NADH基因同源性高達(dá)93％。
　　 4棉花病毒誘導(dǎo)基因沉默體系構(gòu)建
　　 在棉花上用病毒誘導(dǎo)基因沉默是一種基因功能驗(yàn)證的