1、本試驗(yàn)旨在研究亮氨酸對(duì)細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)，及其調(diào)節(jié)是否依賴?yán)着撩顾匕械鞍祝╩ammalian target of rapamycin, mTOR）信號(hào)通路，以及亮氨酸的信號(hào)傳遞到自噬相關(guān)蛋白是否必須通過mTOR上游調(diào)節(jié)蛋白中的Rheb、Raptor或GβL，為開展?fàn)I養(yǎng)素感應(yīng)的信號(hào)通路的深入研究提供策略。
　　 本試驗(yàn)主要包括三部分：(1)培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞(HEK293T)，進(jìn)行時(shí)間梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饑餓

2、后透射電鏡觀察是否產(chǎn)生自噬泡及其產(chǎn)生的規(guī)律，并運(yùn)用western blot方法檢測LC3-11和p62的表達(dá)豐度變化規(guī)律。將LC3-GFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行時(shí)間梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饑餓后共聚焦顯微鏡觀察熒光分布規(guī)律。(2)在0.5h,1h,2h,4h中選取自噬最明顯的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2h,4h)，將細(xì)胞進(jìn)行亮氨酸饑餓，以及有、無雷帕霉素（RAPA）存在條件下亮氨酸饑餓后重新補(bǔ)充亮氨酸

3、，分別檢測LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表達(dá)豐度。(3)運(yùn)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)分別干擾mTOR信號(hào)通路中的Rheb、Raptor或GβL表達(dá)后，在0.5h,1h,2h,4h中選取自噬最明顯的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2h,4h)，將細(xì)胞進(jìn)行亮氨酸饑餓及饑餓后重補(bǔ)充，檢測LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表達(dá)豐度。
　　 研究結(jié)果如下：(1)亮氨酸饑餓0h的細(xì)胞未觀察到自噬泡，LC3-GFP的熒光彌散分

4、布于整個(gè)細(xì)胞胞漿。亮氨酸饑餓0.5h即產(chǎn)生了自噬泡，LC3-GFP的熒光也由彌散分布于胞漿轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠志奂癄顟B(tài)。在4h內(nèi)，自噬泡和LC3-GFP的熒光聚集程度隨亮氨酸饑餓時(shí)間延長而增加，4h達(dá)到頂峰。0h未檢測到LC3-Ⅱ的表達(dá)，p62的表達(dá)量是所有時(shí)間點(diǎn)中最高的。亮氨酸饑餓0.5h后，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著增加(P＜0.01),p62的表達(dá)豐度呈極顯著降低(P＜0.01)。在4h內(nèi)，隨亮氨酸饑餓時(shí)間延長，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈逐漸

5、增加趨勢，4h最多；p62的表達(dá)豐度呈逐漸降低趨勢，4h最少。(2)亮氨酸饑餓2h后，相對(duì)于0h對(duì)照組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度均呈極顯著增加(P＜0.01),p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著降低(P＜0.01)。無RAPA存在時(shí)亮氨酸饑餓2h時(shí)重新補(bǔ)充亮氨酸，相對(duì)于饑餓0h組，LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)豐度變化均不顯著（P＞0.05），pS6K1的表達(dá)豐度呈極顯著降低（P＜0.01）。相對(duì)于饑餓2h組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著降低

6、（P＜0.01），p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著增加（P＜0.01）。有RAPA存在時(shí)亮氨酸饑餓2h后重新補(bǔ)充亮氨酸，相對(duì)于0h組和無RAPA存在時(shí)補(bǔ)充亮氨酸組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著增加(P＜0.01),p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著降低（P＜0.01）。相對(duì)于亮氨酸饑餓2h組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著增加(P＜0.01),p62和pS6K1的表達(dá)豐度變化均不顯著(P＞0.05)。Leu饑餓時(shí)間為4h時(shí)，LC

7、3-Ⅱ、p62和pS6K1的豐度變化趨勢與2h時(shí)一致。(3)干擾Rheb或Raptor后，亮氨酸饑餓2h與饑餓后重新補(bǔ)充的結(jié)果相同。相對(duì)于0h組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度均呈極顯著增加（P＜0.01），p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著降低(P＜0.01)。Leu饑餓時(shí)間為4h時(shí)，LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的豐度變化趨勢與2h時(shí)一致。干擾GβL后，相對(duì)于0h組，亮氨酸饑餓2h時(shí)，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著增加(P＜0.01),p6

8、2和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著降低(P＜0.01)。干擾GβL后重新補(bǔ)充亮氨酸，相對(duì)于0h組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著增加（P＜0.01），p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著降低(P＜0.01)。相對(duì)于饑餓2h組，LC3-Ⅱ的表達(dá)豐度呈極顯著降低(P＜0.01),p62和pS6K1的表達(dá)豐度均呈極顯著增加（P＜0.01）。Leu饑餓時(shí)間為4h時(shí)，LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的豐度變化趨勢與2h時(shí)一致。
　　 本試驗(yàn)