1、木質纖維素是地球上儲量最為豐富的可再生有機碳源，開發(fā)以木質纖維類原料替代糧食資源的燃料乙醇技術，是未來解決燃料乙醇原料成本高、原料有限的根本出路。本文利用分子生態(tài)學技術研究土壤木質纖維素降解過程中微生物群落結構及其動態(tài)演化規(guī)律，挖掘不同階段的優(yōu)勢菌群，探索未來木質纖維素商品化利用的新策略。以西雙版納地區(qū)熱帶雨林土壤為研究對象，以提取的土壤總基因組DNA為模板，分別PCR擴增細菌的16S rRNA基因和真菌的18S rRNA基因，構建16

2、S rRNA及18S rRNA基因文庫，并進行了PCR-RFLP分析。通過對75個不同RFLP帶型所代表的細菌克隆和26個不同RFLP帶型所代表的真菌克隆進行了測序、分析以及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建，分別分析了該土壤中的細菌和真菌群落結構。結果表明，西雙版納地區(qū)熱帶雨林土壤主要的細菌菌群為Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和一個未分類的細菌類群。其中Acidobacteria是細菌菌群的絕對

3、優(yōu)勢菌群，占總克隆數(shù)的89.4％，包含Gp1、Gp2、Gp3和Gp5四個大簇。而真菌菌落大致可以分為三大菌群：Fungi incertae sedis、Ascomycota和Basidiomycota。Fungiincertae sedis是第一大類群，占63.0％，包括Mucoromycotina和unclassifiedZgomycetes兩大亞類群。Ascomycota次之，占總克隆數(shù)的32.4％，而Basidiomycota在此

4、克隆文庫當中檢出比例僅占克隆總數(shù)的4.6％。從已鑒別的微生物類群中，大多數(shù)真菌類群，如Basidiomycota門的Cryptococcus和Panaeolus；Ascomycota門的Tricladium、Aspergillus、Penicillium和Neurospora菌屬等都被報道具有木質纖維素分解能力。
　　 參與土壤中木質纖維素生物降解的微生物類群不僅具有多樣性，而且降解過程按一定的次序進行，參與的微生物類群顯示出明

5、顯的演替規(guī)律。以天然木質纖維素為主要培養(yǎng)基質，分別選取培養(yǎng)8天和15天的土樣再次構建真菌的18S rRNA基因文庫。隨機挑取克隆子進行PCR-RFLP帶型分析，并與先前的帶型結果進行對比，統(tǒng)計帶型比例的變化，并對新的帶型（培養(yǎng)8天出現(xiàn)16個新帶型、15天出現(xiàn)11個新帶型）對應的克隆測序分析。結果表明，培養(yǎng)的不同階段真菌群落結構不斷變化，其優(yōu)勢菌群也隨之變化。最初，以子囊菌類營腐生的污染性機會菌數(shù)量和種類為主，隨著培養(yǎng)時間的延長，子囊菌類

6、逐漸減少，而擔子菌類木腐菌的數(shù)量和種類逐漸增多并最終占主要優(yōu)勢。
　　 微生物對木質纖維素的降解主要通過分泌一系列的酶系來完成。擔子菌在整個降解過程中分布具有持續(xù)的連貫性，并且它是土壤中的主要木腐菌類。我們以擔子菌的木質素降解酶基因作為主要考察指標，進一步從酶基因水平追蹤和解釋微生物降解木質纖維素的演替變化規(guī)律。根據(jù)已公布的擔子菌漆酶基因保守序列設計特異引物，以提取的土壤基因組總DNA為模板，PCR擴增了140 bp的擔子菌種群

7、漆酶基因銅離子結合保守區(qū)與序列。用地高辛標記此段序列作為探針，通過菌落原位雜交從已構建的西雙版納土壤宏基因組文庫中篩選含有該漆酶基因片段的陽性克隆子。通過篩選大約30000個宏基因組克隆，最終一共獲得了六個有雜交信號的克隆子。對其中的一個陽性克隆子進行亞克隆并測序，獲得的測序結果與Gluconolactonase具有較高的同源性。Gluconolactonase和漆酶同屬于氧化酶家族，因此可能參與了木質素的氧化過程。繼續(xù)對陽性克隆子進行