1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。
　　 2006年以來，我國暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的“豬高熱綜合癥”。通過國內(nèi)學(xué)者的大量研究，證實高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病

2、因。1.RT-PCR檢測方法的建立和PRRSVNsp2基因序列的分析為了快速鑒別高致病性PRRSV和經(jīng)典毒株，根據(jù)GenBank公布的基因序列，在Nsp2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)設(shè)計并合成了一對引物，經(jīng)典毒株擴增片段為734bp，而高致病性PRRSV擴增片段為644bp，建立了能區(qū)分經(jīng)典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR診斷方法。利用建立的方法對采集的江蘇地區(qū)臨床病料進行了檢測，結(jié)果表明臨床病料陽性率為40％，且流行毒株都是PR

3、RSV變異株。利用設(shè)計的歐洲型PRRSV引物對臨床樣品檢測，未檢測到歐洲型PRRSV。
　　 對18株P(guān)RRSV分離株的Nsp2基因序列分析，結(jié)果表明，18株病毒的Nsp2基因擴增大小均為644bp。與美洲型代表毒株VR-2332的氨基酸同源性在57.5％-68.7％，與高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分別在82.2％-97.6％、80.4％-95.3％。且18株病毒的Nsp2存在30個氨基酸的不連續(xù)缺

4、失，缺失位置與JXA1相同。
　　 2.高致病性PRRSVRD2007的分離和鑒定選取PCR檢測陽性樣品，組織研磨無菌化處理，離心取上清接種于單層的Marc-145細胞，結(jié)果在培養(yǎng)第2代時，細胞出現(xiàn)明顯病變，主要表現(xiàn)為細胞聚集、成簇，發(fā)生裂解。將細胞懸液進行RT-PCR檢測擴增出644bp大小的片段，用抗PRRSVN蛋白單抗做間接免疫熒光檢測，結(jié)果感染細胞可見綠色熒光。證明本研究分離到一株P(guān)RRSV，命名為RD2007。

5、　　 3.高致病性PRRSVRD2007株的全基因組序列分析為了解RD2007株的基因變異情況，通過RT-PCR分段擴增并測定RD2007株的全基因組序列，序列分析結(jié)果表明：RD2007株屬于美洲型毒株，Nsp2蛋白中存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失。與經(jīng)典毒株VR-2332的全基因組核苷酸同源性是89.2％，與國內(nèi)分離株的JXA1株的基因組核苷酸同源性在99.1％，遺傳進化分析表明RD2007與國內(nèi)高致病性PRRSV親緣關(guān)系較近，有著共

6、同的祖先。
　　 4.PRRSVN基因的克隆及原核表達根據(jù)GeneBank發(fā)表的PRRSVATCCVR-2332株ORF7基因序列，設(shè)計并合成一對引物，利用RT-PCR方法擴增ORF7基因片段。將擴增片段克隆至pGEM-TEasy載體中，構(gòu)建N基因重組載體pGEM-T-N。將ORF7基因片段再克隆至pET32a表達載體中，通過酶切分析，結(jié)果獲得陽性表達質(zhì)粒pET32a-N。然后將pET32a-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)