1、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）是腸產(chǎn)毒性大腸桿（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）分泌的一種熱不穩(wěn)定腸毒素，LT是由一個(gè)具有毒性的A亞單位（LTA）和形成環(huán)狀的五個(gè)能夠與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合而粘附于真核細(xì)胞膜上的B亞單位（LTB）組成。能引起人和其他哺乳動(dòng)物的水樣腹瀉。LT除具有毒性外，還能夠有效的啟動(dòng)局部及全身的體液和細(xì)胞免疫，具有很強(qiáng)的粘膜免疫原

2、性和粘膜佐劑活性，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開(kāi)發(fā)中具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　 為制備大量具有免疫活性的LT蛋白，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取產(chǎn)腸毒素大腸桿菌44815菌株的基因組，采用PCR方法分別擴(kuò)增不耐熱腸毒素A亞基（LTA）和B亞基（LTB）的編碼基因，并將其連接在pMD18-T載體上，構(gòu)建成LTA和LTB基因的重組載體pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB。陽(yáng)性克隆篩選采用藍(lán)白斑選擇和限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和Nco

3、Ⅰ消化，最后進(jìn)行序列測(cè)定。然后采用定點(diǎn)突變方法將LTA的第63位的絲氨酸改變?yōu)橘?lài)氨酸，構(gòu)建成pMD18-T-LTAK63突變體。再分別將pMD18-T-LTAK63和pMD18-T-LTB通過(guò) XhoⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)插入到pET-20b(+)原核表達(dá)載體，分別構(gòu)建成LTA和LTB的原核表達(dá)載體pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB。將重組LTA和LTB表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化宿主菌Bl21，制備工程菌進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物采用SDS-

4、PAGE方法檢測(cè)，目的蛋白分離純化采用鎳瓊脂糖膠粒吸附法。為鑒定帶有人CD5信號(hào)肽的LTAK63基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，以pMD18-T-LTAK63為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增LTAK63基因，將LTAK63基因連接在pcDNACD5sp真核表達(dá)載體上，構(gòu)建成LTAK63重組質(zhì)粒pcDNACD5sp-LTAK63。利用磷酸鈣方法將pcDNACD5sp-LTAK63轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T細(xì)胞使其瞬時(shí)表達(dá)。
　　 本研究構(gòu)建

5、的重組質(zhì)粒pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB的測(cè)序結(jié)果表明：所克隆的LTA基因與GenBank中大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株LTA基因的大小完全一致，有4個(gè)堿基發(fā)生了改變，同源性為99％。在這4個(gè)突變中有3個(gè)是無(wú)義突變，不造成氨基酸的改變，但有1個(gè)堿基的突變使谷氨酸變?yōu)橘?lài)氨酸。可見(jiàn)LTA基因存在著多態(tài)性；所克隆的LTB基因與GenBank中大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株LTB基因的完全一致，同源性為100％。利用定點(diǎn)突變方法構(gòu)建的pMD18-T-

6、LTAK63突變體的測(cè)序結(jié)果表明LTA的第63位的絲氨酸成功的改變?yōu)橘?lài)氨酸。構(gòu)建的原核表達(dá)載體經(jīng)XhoⅠ和NcoⅠ雙酶切，得到了符合預(yù)期大小的特異性片段，結(jié)果證明pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。SDS-PAGE檢測(cè)宿主菌Bl21表達(dá)目的蛋白的結(jié)果顯示：在細(xì)胞周質(zhì)中有目的蛋白表達(dá)，分別在分子量約為28Kda（LTA)及14Kda（LTB）處有一條明顯的帶。而在細(xì)胞的培養(yǎng)基及包涵體中未見(jiàn)目的蛋白表達(dá)

7、。同時(shí)通過(guò)鎳吸附法純化得到了單一目的蛋白。結(jié)果表明LTAK63和LTB在Pel信號(hào)肽的引導(dǎo)下進(jìn)行了表達(dá)并分泌到細(xì)胞周質(zhì)，而不是以包涵體形式存在，因此表達(dá)目的蛋白具有一定的活性，且易于分離純化。在LTAK63基因進(jìn)行真核表達(dá)的基礎(chǔ)上構(gòu)建的pcDNACD5sp-LTAK63真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在分子量約為34.8KDa處有一條明顯的雜交帶，而空載體在相應(yīng)位置未見(jiàn)雜交帶。結(jié)果證明pcDNAC