1、以玉米雜交種鄭單958種子為實驗材料,利用人工加速老化處理、TTC染色法和種子萌發(fā)實驗,對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及多項生理指標,尤其是種子蛋白質(zhì)組的變化進行了比較研究,以鑒定鄭單958種子活力的標記蛋白質(zhì)分子。主要研究結果如下:
　　 1、老化處理后,種子多項生理指標發(fā)生了明顯變化
　　 種子活力隨著老化處理進程而降低。和對照相比,老化1天的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別降低了7％和3％；老化2天和3天的發(fā)芽勢和發(fā)芽率急劇降低,到

2、老化第三天,發(fā)芽勢降低了74％,發(fā)芽率降低了64％；老化6天的發(fā)芽勢和發(fā)芽率全部為O。說明種子發(fā)芽勢對老化處理的敏感性要高于發(fā)芽率。TTC染色結果顯示,種子活力隨著老化程度的加劇而降低,自然老化和人工老化的種子均可分為染色深、淺和不染色的三類,但TTC法測定的種子活力要高于發(fā)芽實驗的測定結果。
　　 在人工加速老化過程中,隨著種子劣變加劇,種子內(nèi)MDA和可溶性糖含量增加。MDA含量隨老化時間逐漸升高,可溶性糖含量在老化第2天最高

3、:抗氧化系統(tǒng)的SOD、CAT和POD三種酶活性均隨著老化天數(shù)的增加而降低。而POD酶活性在老化2天后變化不明顯；可溶性蛋白質(zhì)含量也因老化處理而緩慢下降。
　　 2、老化處理后,種子蛋白質(zhì)組發(fā)生了明顯變化,尤其是種胚的蛋白質(zhì)組
　　 SDS—PAGE分析表明,老化過程在促進玉米種子蛋白質(zhì)降解的同時,也誘導一些蛋白質(zhì)的豐度上調(diào)和新蛋白質(zhì)的合成；胚乳與種胚蛋白質(zhì)均出現(xiàn)了差異,尤其是在種胚中。對不同活力種胚的蛋白質(zhì)電泳分析發(fā)現(xiàn),

4、一種14 kDa蛋白質(zhì)豐度的變化最大:在低活力種子中的含量明顯減少。
　　 鑒于老化6天與0天(對照)的種胚蛋白質(zhì)差異顯著,取對照和老化6天的種胚蛋白質(zhì)進行了2-D電泳分析。雙向電泳凝膠上可分辨出約750個考染的蛋白質(zhì)點,選取豐度變化在3倍以上的4個點(包括上述14 kDa蛋白質(zhì))進行質(zhì)譜鑒定。同源性序列比對表明,這四種蛋白質(zhì)分別是胚胎晚期豐富蛋白質(zhì)(LEA)EMB564(Swissprot登錄號P46517)、表達蛋白(NCB

5、I登錄號NP_001142211)、脂蛋白(Swissprot登錄號ACG48482)和葡糖/果糖脫氫酶(NCBI登錄號NP_001140439)。上述14kDa的蛋白質(zhì)為EMB564。
　　 3、盾片中的EMB564可作為鄭單958種子活力的標記分子
　　 為進一步確定EMB564在種胚中的組織定位,分別從未萌發(fā)的老化/對照種子的胚芽、胚根和盾片中提取蛋白質(zhì)進行電泳分析。在未萌發(fā)的種子中,EMB564在胚芽、胚根和盾片

6、中均存在,其含量在老化、正常盾片中差異最明顯。在種子萌發(fā)過程中,盾片中EMB564含量隨著種子發(fā)育進程而減少,可能是由于種子萌發(fā)過程中被重新利用。另外,發(fā)芽勢低的種子盾片中EMB564的豐度高于發(fā)芽高的,在活力較弱的種子盾片中幾乎不可見。2-D電泳分析和MALDI-TOF質(zhì)譜分析,進一步證實了上述結果。
　　 通過信息生物學軟件分析了EMB564的親/疏水性以及二級、三級結構。通過與已知的LEA蛋白質(zhì)序列同源性比對表明,EMB5

7、64是LEA第1家族中的成員。其二級結構比較簡單,包含了7個片段的不規(guī)則彎曲,占整個氨基酸序列的61.5％,3個片段屬于α-螺旋結構,占26％,無β-折疊結構。EMB564的三級結構與DNA結合蛋白相似,帶有兩個空間成垂直排列的α-螺旋,其余為無規(guī)則卷曲。目前關于LEA蛋白的功能還不清楚。EMB564的空間結構暗示,它可能有結合DNA、在脫水干燥脅迫下起保護DNA的作用。
　　 本論文應用生理學和蛋白質(zhì)組學結合的方法,發(fā)現(xiàn)EMB