1、干旱是影響植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫因子,也是制約我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一,據(jù)統(tǒng)計干旱給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失幾乎是其它自然災害所造成損失的總和。通過分子育種提高作物耐旱性獲得抗旱材料是當前人類面臨的重大課題。番茄(Solanum lycopersicum)是一種世界種植的蔬菜,培育抗旱番茄品種具有重要意義。同時,番茄又是一種模式植物,基礎(chǔ)研究比較深入,遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成熟,便于進行基因功能的驗證。本實驗室利用抗旱性野生番茄品種S.pe

2、nnellii創(chuàng)制的漸滲系群體中篩選出的耐旱系及其干旱敏感的受體品種M82為材料,與番茄Oligo cDNA芯片雜交,獲得大量干旱響應上調(diào)和下調(diào)表達基因。本研究利用芯片從中篩選出干旱脅迫前后表達量差異較大的基因作為候選基因,構(gòu)建超量表達載體,并通過遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)腚p子葉植物中,獲得轉(zhuǎn)基因植株,應用不同濃度的PEG進行模擬干旱處理,對基因功能進行初步驗證,為下一步系統(tǒng)分析基因的生物學功能及其作用的分子機理奠定了基礎(chǔ)。本研究獲得的主要

3、結(jié)果有:
　　 1.芯片結(jié)果顯示,在干旱脅迫處理后,SpPRP基因、SpPRPP基因和SpCTF2A基因的表達量分別增加了11.1倍、22.6倍和18.1倍。本研究選取SpPRP基因和SpPRPP基因這兩個基因作為候選基因,通過芯片結(jié)果得到候選基因的EST序列,應用生物信息學分析,得到全長cDNA序列,設(shè)計引物,克隆得到兩個候選基因的全長cDNA。測序結(jié)果表明SpPRPP基因全長789bp,完整的讀碼框共編碼261個氨基酸;Sp

4、PRP基因全長981bp,完整的讀碼框共編碼325個氨基酸。通過氨基酸比對結(jié)果表明,這兩個基因與其他植物的同類基因也具有較高的同源性。
　　 2.提取S.pennellii和M82不同組織部位的RNA,半定量RT-PCR,分析發(fā)現(xiàn)3個基因在S.pennellii和M82中都具有明顯的組織表達特異性。SpCTF2A基因在S.pennellii和M82的不同組織部位均有表達,其中在S.pennellii的莖葉花中表達量較高,在M82

5、的莖花果中表達量較高。SpPRP基因在M82的根和花中表達量較高,SpPRPP基因在M82的莖和花中表達量較高,SpPRP和SpPRPP基因在S.pennellii的葉花中表達量較高,且這兩個基因在花中的表達量均最高。
　　 3.提取M82在鹽、高溫和冷脅迫不同逆境處理以及Ethy,SA,ABA和JA不同激素處理下的RNA,半定量RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)基因SpCTF2A在三種脅迫處理下表達量與對照相比均有明顯增加,且對SA、JA

6、和ABA處理均發(fā)生響應,但是在Ethy處理下表達量沒有明顯變化；SpPRPP基因在鹽處理和冷處理下表達量增加,在高溫處理下表達量有少量降低,在激素處理下只在ABA和SA誘導下表達量顯著升高；SpPRP基因在三種逆境脅迫下表達量都明顯上升,在激素處理下對Ethy和SA發(fā)生快速響應。
　　 4.分別構(gòu)建了SpPRP基因和SpPRP基因的超量表達載體；利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將SpPRP基因,SpPRPP基因和SpCTF2A基因的

7、超量表達載體成功導入番茄品種ZS5、AC和M82,及煙草(Nicotiana tabacum)品種K326中。
　　 5.番茄遺傳轉(zhuǎn)化共獲得卡那霉素抗性植株84株,其中轉(zhuǎn)SpPRP基因共19株,轉(zhuǎn)SpPRPP基因共35株,轉(zhuǎn)SpCTF2A基因共30株；煙草卡那霉素抗性植株50株,其中轉(zhuǎn)SpPRP基因共有15株,轉(zhuǎn)SpCTF2A基因共35株。PCR檢測結(jié)果初步表明,外源基因已整合到番茄基因組中。
　　 6.利用8％的PEG