1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是雛鴨的一種高度致死性急性傳染病，以肝炎為其主要特征，病原是鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)。我國(guó)流行的鴨肝炎以1型DHV(DHV1)為主。疫苗接種是本病最有效的預(yù)防措施，我國(guó)目前尚無(wú)商品化疫苗。本研究將自行分離鑒定的一株DHV1 A株，通過(guò)雞胚傳代培育和克隆化選育，獲得了致弱的疫苗候選毒株A66株；在對(duì)A66毒株的安全性、免疫原性、純凈性和遺

2、傳穩(wěn)定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究鴨病毒性肝炎活疫苗(A66株)的安全性和效力、生產(chǎn)工藝和中試生產(chǎn)，并在農(nóng)業(yè)部行政審批許可后開(kāi)展了疫苗臨床試驗(yàn)工作，最終完成了鴨病毒性肝炎活疫苗(A66株)研制。
　　 1、DHV1 A株的分離鑒定與弱毒株的培育和純化
　　 對(duì)安徽省臨床自然發(fā)病雛鴨的肝臟病料通過(guò)9日齡的雞胚進(jìn)行病毒分離，獲得了一株病毒，命名為A毒株。通過(guò)人工發(fā)病試驗(yàn)、雞胚中和試驗(yàn)、雞胚交叉中和試驗(yàn)、被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)、酶標(biāo)S

3、PA斑點(diǎn)試驗(yàn)及電鏡觀察，從動(dòng)物試驗(yàn)、血清學(xué)反應(yīng)和病毒形態(tài)上鑒定A毒株為DHV1。
　　 以DHV1A株經(jīng)雞胚傳代致弱的E60為始發(fā)毒，采用有限稀釋法接種SPF雞胚進(jìn)行3次克隆化篩選、2次純培養(yǎng)和1次擴(kuò)大培養(yǎng)至66代次，通過(guò)毒價(jià)、免疫原性和特異性測(cè)定、及其純凈性和外源病毒檢驗(yàn)，表明A株經(jīng)雞胚傳代致弱已失去對(duì)雛鴨的致病性，符合疫苗研制毒種要求。因此，確定以DHV1A株經(jīng)雞胚傳代致弱和純化的E66代雞胚毒作為鴨病毒性肝炎活疫苗研發(fā)的原

4、始毒種，并命名該致弱株為DHV1A66株。
　　 2、DHV A66弱毒株的安全性、免疫原性和純凈性
　　 以DHV1A66株E66代次種毒，分別經(jīng)皮下注射和口服途徑大劑量接種1日齡敏感雛鴨各10只，接種雛鴨臨床觀察正常，剖檢觀察肝臟等內(nèi)臟組織無(wú)肉眼可見(jiàn)病理變化，肝臟等組織切片檢查無(wú)異常。再以該種毒經(jīng)皮下注射途徑大劑量接種1日齡敏感雛鴨20只，于接種后不同時(shí)間采集血液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、血沉測(cè)定、血紅蛋白測(cè)定等血常規(guī)檢查，同時(shí)

5、取血樣分離血清進(jìn)行反映肝臟機(jī)能狀態(tài)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)等血清酶和膽紅素測(cè)定。結(jié)果顯示：試驗(yàn)鴨的血常規(guī)及四種血清酶和總膽紅素(TBIL)測(cè)定值與健康對(duì)照鴨均無(wú)明顯差異，但強(qiáng)毒對(duì)照鴨于接毒后24-36h的測(cè)定值與健康鴨有顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。
　　 毒株遺傳穩(wěn)定性方面，以DHV1A66株E66代次的種毒，每次用1～3日齡敏感雛鴨10只

6、，連續(xù)傳代回歸10次進(jìn)行毒力返強(qiáng)試驗(yàn)。結(jié)果各回歸代次雛鴨肝組織能穩(wěn)定分離到DHV，且組織含毒量相對(duì)穩(wěn)定在103.5-4.8ELD50/ml范圍；各代次回歸試驗(yàn)鴨健康，剖檢觀察正常，病理組織學(xué)檢查正常；各代次試驗(yàn)鴨的血液常規(guī)指標(biāo)、四種主要血清酶和總膽紅素(TBIL)值均正常。對(duì)DHV1的A66-F10與F0全基因組序列比對(duì)和分析表明，全基因組核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生插入或缺失，兩者僅有6個(gè)核苷酸差異，同源性達(dá)99.9％以上，ORF氨基酸序列未發(fā)

7、生改變.充分證明DHV1A66弱毒株具有良好的安全性和遺傳穩(wěn)定性。
　　 以DHV1 A66株種毒經(jīng)9～10日齡SPF雞胚連續(xù)傳代至E80代，通過(guò)對(duì)不同代次種毒的病毒含量及對(duì)1日齡雛鴨的毒力和免疫力的測(cè)定，結(jié)果表明：不同代次種毒毒價(jià)在108.10-8.50ELD50/ml之間，皮下注射免疫的半數(shù)免疫量(IMD50)在106.10-6.40IMD50/ml范圍，表明A66株免疫性穩(wěn)定而良好。因此，確定E66為原始種子代次，基礎(chǔ)種子

8、代次為E67～72，種子繼代培養(yǎng)不超過(guò)3代，即生產(chǎn)用抗原最高代次為E75。通過(guò)對(duì)A66株E66、E70和E75代次雞胚混合毒的最小免疫量測(cè)定，并取A66株雞胚傳代較高代次E75以不同倍數(shù)最小免疫量進(jìn)行免疫試驗(yàn)，確定A66株的最小免疫量為103.3ELD50；根據(jù)免疫試驗(yàn)結(jié)果及其它因素綜合考慮，確定A66株的免疫劑量(即使用劑量)應(yīng)≥104.3ELD50。
　　 按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法，對(duì)A66株種毒E66、E70代毒種進(jìn)

9、行無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果細(xì)菌和支原體檢驗(yàn)陰性，12種現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定檢測(cè)的外源病毒和雞傳染性貧血病毒(CIAV)也全部為陰性，表明DHV1 A66毒株毒種純凈。
　　 3、檢驗(yàn)用鴨肝炎強(qiáng)毒株(W株)的系統(tǒng)鑒定
　　 通過(guò)對(duì)DHV1 W強(qiáng)毒株接種雛鴨復(fù)壯，進(jìn)行病毒傳代、毒力及其穩(wěn)定性測(cè)定、血清學(xué)特異性及與DHV1 R85952強(qiáng)毒參考株進(jìn)行毒力比較試驗(yàn)等，認(rèn)定DHV1 W毒株可作為檢驗(yàn)用強(qiáng)毒。對(duì)W毒株的攻毒劑量

10、和保存期試驗(yàn)表明：W株的攻毒劑量1～7日齡選用103.0LD50/鴨，7～10日齡選用104.0LD50/鴨；W株的肝組織毒凍干后在-20℃和-70℃中保存期分別可達(dá)5年和8年。
　　 4、鴨肝炎活疫苗(A66株)的安全性、效力和保存期
　　 對(duì)5批實(shí)驗(yàn)室制備的A66活疫苗，分別通過(guò)皮下注射、口服途徑對(duì)1日齡敏感雛鴨進(jìn)行一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和一次大劑量接種的安全性試驗(yàn)。臨床觀察試驗(yàn)雛鴨的精神、采食、飲水、生長(zhǎng)、

11、增重等均正常，肝功能檢查、解剖觀察肝臟等內(nèi)臟組織器官及肝臟組織切片檢查無(wú)異常。試驗(yàn)結(jié)果表明：A66活疫苗對(duì)雛鴨使用安全性好、無(wú)副作用。
　　 用A66弱毒株最高代次(E75代)生產(chǎn)用毒種制備的三批疫苗，每批疫苗分別經(jīng)皮下注射、肌肉注射、飲水和口服途徑免疫易感雛鴨各10只。試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)皮下和肌肉注射途徑免疫雛鴨，2～3天就能產(chǎn)生免疫保護(hù)力；經(jīng)口服、滴鼻和飲水途徑免疫雛鴨，5天能產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。以該三批疫苗1/10使用劑量免

12、疫1日齡易感雛鴨5天后(120h)用強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒，免疫組雛鴨全部保護(hù)，表明用A66最高代次毒種制備的疫苗仍具有良好的免疫效力。將疫苗按免疫劑量接種1日齡易感雛鴨，雛鴨的免疫期至少達(dá)60天以上，即一次免疫就能有效保護(hù)雛鴨安全度過(guò)易感期(6周齡以內(nèi)雛鴨)。
　　 采用10倍免疫劑量的A66活疫苗，分別經(jīng)皮下注射和口服途徑接種1日齡易感雛鴨各20只，5日后隨機(jī)取出其中10只與20只1日齡易感雛鴨進(jìn)行第1代同居飼養(yǎng)5日，再取10只同居

13、感染鴨與20只1日齡易感雛鴨進(jìn)行第2代同居感染試驗(yàn)，如此連續(xù)進(jìn)行5代次的同居感染試驗(yàn)。通過(guò)定時(shí)采集接種鴨及同居鴨肛拭子樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，測(cè)定DHV1 A66的感染和排毒情況；對(duì)接種或同居5日的試驗(yàn)鴨進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，測(cè)定同居感染的保護(hù)情況。結(jié)果表明：A66活疫苗經(jīng)皮下注射和口服途徑接種雛鴨，均可以通過(guò)糞便向體外排泄病毒；同居易感雛鴨可經(jīng)糞-口途徑接觸感染，感染雛鴨可獲得鴨肝炎的免疫保護(hù)；同居感染現(xiàn)象隨著同居代次的增加，同居感染的排毒時(shí)

14、間逐漸延遲、感染率逐步下降，至同居5代時(shí)這種同居感染現(xiàn)象基本終止。
　　 選擇經(jīng)鴨肝炎疫苗免疫的種鴨所產(chǎn)種蛋孵化的雛鴨，采用雞胚中和試驗(yàn)測(cè)定其鴨肝炎母源抗體水平；對(duì)不同母源抗體水平的雛鴨于1日齡時(shí)用1羽份疫苗進(jìn)行免疫，分別于免疫后2天和5天用DHV1 W強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果表明，母源抗體水平對(duì)鴨肝炎活疫苗免疫效果無(wú)明顯影響。
　　 以制備的3批A66株活疫苗分別經(jīng)過(guò)不同保存溫度、不同保存期后，測(cè)定其雞胚半數(shù)致死量(ELD50)

15、的變化情況，判定疫苗的穩(wěn)定性；通過(guò)對(duì)疫苗的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)、物理性狀觀察、水分及真空度測(cè)定，以確定疫苗的保存期。試驗(yàn)結(jié)果表明：A66活疫苗在-15℃條件下可保存2年以上，2～8℃條件下可保存1年以上；疫苗用生理鹽水稀釋后在室溫(25)℃條件下存放8h毒價(jià)下降不明顯。
　　 5、鴨肝炎活疫苗(A66株)的生產(chǎn)工藝研究和中試生產(chǎn)
　　 選擇蔗糖、明膠、蛋白(氨基酸)等組份，與真空度、升溫速度等因素，通過(guò)水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行凍

16、干保護(hù)劑篩選和凍干曲線的優(yōu)化研究。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定A66株活疫苗生產(chǎn)工藝為：種毒以100～1000倍稀釋、經(jīng)尿囊腔途徑接種9～11日齡SPF雞胚，0.2ml/胚，收獲接種后36～72h死亡雞胚組織(胚體+胚膜+胚液)，用組織搗碎機(jī)勻漿3～5分鐘后保存；優(yōu)化的保護(hù)劑配方和凍干條件為：5％蔗糖，1.5％明膠、6％甘氨酸的保護(hù)劑，真空度0.02 mbar，升溫速度為1.5℃/min?？乖c保護(hù)劑1:1比例，在凍干曲線：-40℃3 h；-25℃

17、13 h；-10℃4h；25℃4h時(shí)，疫苗凍干效果最佳。按照確定的保護(hù)劑和凍干條件驗(yàn)證3批產(chǎn)品，其物理性狀、真空度、殘余水分含量均符合《中國(guó)獸藥典》規(guī)定，3批疫苗凍干前后毒價(jià)損失≤100.6滴度。
　　 按照本研究制定的《鴨病毒性肝炎活疫苗中間試制規(guī)程及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(草案)，在南京天邦生物科技有限公司進(jìn)行中試生產(chǎn)了5批A66活疫苗，共計(jì)605萬(wàn)羽份。5批疫苗按照中間試制規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、病

18、毒含量、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、剩余水分測(cè)定、真空度測(cè)定均符合標(biāo)準(zhǔn)。表明該疫苗生產(chǎn)工藝合理，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合規(guī)模化生產(chǎn)。
　　 6、鴨肝炎活疫苗(A66株)臨床試驗(yàn)
　　 2008年12月27日獲得農(nóng)業(yè)部獸用生物制品臨床試驗(yàn)批件(批件號(hào)：200844)后，自2009年2月至6月在安徽省5個(gè)鴨場(chǎng)(企業(yè))應(yīng)用5個(gè)批次的中間試制產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)共計(jì)免疫雛鴨5.9萬(wàn)羽。經(jīng)臨床觀察、攻毒試驗(yàn)、抗體檢測(cè)及生產(chǎn)性能的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果