1、家蠶可謂是二十世紀最為重要的經(jīng)濟昆蟲,也是目前繼果蠅以后最為重要的生物學(xué)研究模型昆蟲之一。家蠶由于經(jīng)過長期的室內(nèi)飼養(yǎng)與經(jīng)濟性狀的改良,逐漸的失去野性,變得對環(huán)境條件尤其是溫度非常敏感。因此,研究家蠶的耐高溫特性以及在分子水平上研究對高溫沖擊的反應(yīng)如熱激蛋白的合成等不僅具有重要的理論意義而且有很好的實踐指導(dǎo)意義。特別是對于選育適應(yīng)在熱帶和干旱地區(qū)及中國的夏秋蠶季節(jié)飼養(yǎng)的蠶品種,探明家蠶品種的耐熱性能及機理尤為重要。自20世紀中葉第一次發(fā)現(xiàn)

2、熱激能誘導(dǎo)果蠅合成熱激蛋白,進一步的研究發(fā)現(xiàn)從細菌到人類都具有合成熱激蛋白的能力,因而認識到熱激反應(yīng)是一個普遍的生物學(xué)現(xiàn)象,熱激蛋白研究也成為當前分子生物學(xué)研究的熱點。本項目應(yīng)用雙向電泳技術(shù),結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和實時熒光定量PCR等分子生物學(xué)先進手段,選擇遺傳背景差異很大,耐高溫性狀差異特別明顯的不同家蠶(Bombyx mori)品種為材料,在分子水平研究家蠶對熱激反應(yīng)特別是熱激蛋的合成種類、品種間的差異及與耐高溫性的關(guān)系。
　　 本

3、試驗選取了四個不同家蠶品種分別為:菁松,中國系統(tǒng)二化多絲量品種,對高溫比較敏感；皓月,日本系統(tǒng)二化多絲量品種,對高溫很敏感；Nistari,熱帶無滯育多化性少絲量品種,對高溫耐性好；P50,有滯育多化性少絲量品種,對高溫耐性中等。家蠶各品種在標準飼養(yǎng)技術(shù)與條件下飼養(yǎng)至五齡第4天,分別用45℃熱激30分鐘或41℃熱激1小時。然后在標準飼養(yǎng)溫度(24℃)中恢復(fù)2小時或4小時,取樣分別解剖血液、脂肪體、絲腺體、卵巢、睪丸等器官進行試驗,得到如

4、下研究結(jié)果。1.雙向電泳實驗結(jié)果證明,本試驗所用的所有品種經(jīng)熱激處理與對照比較,都有明顯可見的熱激蛋白產(chǎn)生。經(jīng)過多次重復(fù)實驗,都得到了重復(fù)性很好的試驗結(jié)果,在4個不同品種、不同熱激溫度處理、雌雄性別及2次重復(fù)試驗中都檢測到了25個差異表達的熱激蛋白,其中9個為普遍反應(yīng)表達蛋白,這16個共有熱激蛋白中,5個在凝膠的低分子區(qū)域,分別編號1、2、3、4、9號,4個在高分子區(qū)域,分別編號為5、6、7、和8號。2.實驗還在凝膠的低分子區(qū)域檢測到了

5、16個品種特異反應(yīng)的熱激蛋白表達,其中Nistari有9個,菁松有4個,皓月有3個,而P50一個也沒有。因此不同家蠶品種有多個共有熱激蛋白的合成,但特異反應(yīng)則品種間有顯著差異。3.用MALDITOF/TOF質(zhì)譜儀檢測分析,熱激處理后檢測到的25個差異表達蛋白,有10個被鑒定為熱激蛋白(HSPs),其中6個sHSP,4個為HSP70。這10個被鑒定為HSPs當中的8個為共有反應(yīng)熱激蛋白(4個sHSP,4個HSP70),2個為特異反應(yīng)熱激蛋

6、白(都是sHSP)。被MS/MS鑒定出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列覆蓋率為29％82％。本試驗在所有品種中檢測到四種可誘導(dǎo)的HSP70屬于HSP70家屬,具有不同等電點和分子量的共有熱激蛋白；六種sHSP包括19.9、20.1、20.4、20.8、21.4和23.7為家蠶可誘導(dǎo)的sHSP。其中HSP19.9、HSP20.4、HSP20.8和HSP23.7為共有表達蛋白,HSP20.1只在菁松中特異表達,HSP21.4只在Nistari中特異表達

7、。4.熱激處理后在實驗中檢測到的差異表達蛋白點2號很明顯是sHSP,但PMF和MS/MS分析都不能與數(shù)據(jù)庫中的任何sHSP相匹配,多次反復(fù)試驗結(jié)果相同,可能是因為目前家蠶有限的基因組數(shù)據(jù)庫而未能鑒定,有待進一步分析研究。5.針對不同對熱激反應(yīng)蛋白質(zhì)表達共性和特異性的差異,選擇菁松和Nistari兩個品種,熱激處理后恢復(fù)2小時的脂肪體中可誘導(dǎo)HSPs,應(yīng)用2DGE分析進行定量研究并進行統(tǒng)計檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),45℃熱激處理,sHSPs的表達在

8、多化性品種Nistari中的表達比二化性品種菁松中的表達低,但是在41℃熱激處理卻區(qū)則兩者之間并無顯著差異。也就是說,在比較溫和的熱激處理后,不同耐熱性的蠶品種在sHSPs表達量上沒有顯著差異,而在較高的溫度熱激時,耐高溫好的Nistari在sHSPs表達量顯著的低(P＜0.01)。相反,HSP70的表達量在不同品種和不同熱激溫度之間都沒有顯著差異。6.熱激處理后恢復(fù)時間經(jīng)過2小時和4小時之間在不同品種和處理的熱激蛋白表達種類上沒有差異

9、,但在不同熱激蛋白的表達量上有顯著差異,特別是耐高溫很強的Nistari品種中sHSP的表達量顯著增加,這可能暗示了sHSP的表達與家蠶品種的耐高溫性能有著更加密切的關(guān)系。7.不同性別比較發(fā)現(xiàn),sHSP和HSP70表達在雌雄之間有些可見的差異,但統(tǒng)計分析都沒有達到極顯著差異水平(P＜0.01)。8.應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對上述定量差異進一步進行驗證,對兩個熱激蛋白HSP19.9和HSP70的編碼基因進行mRNA表達水平定量研究,結(jié)果

10、非常一致。RNA轉(zhuǎn)錄水平:品種間耐熱性低的菁松高于耐熱性強的Nistari；處理問41℃熱激高于45℃熱激處理；不同熱激蛋白間HSP19.9高于HSP70；雌雄間雄性高于雌性。9.在日系耐熱性差的品種皓月中檢測到sHSPs之間表達差異很大:HSP19.9和HSP23.7表達較低,而HSP20.4表達很高,未被鑒定出的2號蛋白點表達量很低。10.在所有本試驗所選的品種中,其卵巢和精巢中可檢測到三種HSPs兩種sHSPs(HSP19.9、H

11、SP20.4)和HSP70的表達,既有上調(diào)也有下調(diào)。11.本實驗應(yīng)用雙向電泳技術(shù)和MALDI-TOF-TOF光譜分析鑒定,檢測到了家蠶基因組中所有的sHSP,認為所有家蠶品種中至少有7個小分子熱激蛋白和4個具有不同PI和分子量的HSP70是熱激可誘導(dǎo)的,并與家蠶幼蟲的耐熱性有關(guān)。12.在本實驗中檢測到的9個特異表達熱激蛋白中只有兩個被鑒定為sHSP,說明現(xiàn)有的家蠶基因組數(shù)據(jù)庫的限制,有待進一步完善。特異表達熱激蛋白都落在小分子區(qū)域,并且