1、本實驗以嚴重影響豬生長、健康、繁殖的8種重要的病原為研究對象，構(gòu)建了能同時、快速、診斷這8種病原的cDNA芯片檢測技術(shù)的平臺。本實驗研究的相關(guān)病原有豬日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、口蹄疫病毒O型和AISAⅠ型（Foot-and-Mouth Disease O and AISAⅠ，F(xiàn)MDV-O and FMDV-

2、 AISAⅠ).、豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬細小病毒 (Porcine parvovirus，PPV)、豬圓環(huán)病毒-Ⅱ型(Porcine circoviruses-Ⅱ，PCV-2)和豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）。
　　 基因芯片技術(shù)是90年代伴隨著人類基因組計劃

3、的實施而發(fā)展起來的一項新技術(shù)，它采用了并行處理和高度集成技術(shù)，是一種快速、高效、并行、高通量的基因水平的診斷技術(shù)，可以應(yīng)用于并行檢測數(shù)百個疾病相關(guān)分子。生物芯片技術(shù)在科學研究上的廣泛應(yīng)用，并逐步發(fā)展成為實驗室中的常規(guī)分子生物學技術(shù)，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，有很多優(yōu)點，如大規(guī)模、高通量、快速檢測等。
　　 本研究希望構(gòu)建一種在基因水平提供處理一次樣品就可以鑒別診斷這8種病原的基因芯片診斷方法。研究的內(nèi)容主要包括：選取JEV、PRV、

4、PRRSV、PPV、PCV-2、CSFV、FMDV-O、FMDV-AISAⅠ病原核酸的保守區(qū)域，設(shè)計8對特異性引物，對經(jīng)細胞培養(yǎng)的8種病原提取的核酸作為模板，進行PCR擴增，將8種病原擴增產(chǎn)物連接到PMDT-18載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標準品，經(jīng)PCR擴增質(zhì)粒標準品并濃縮純化作為探針，以0.6μg/μL的濃度點制于經(jīng)過氨基修飾的玻片上；另以經(jīng)細胞培養(yǎng)的8種病原提取的核酸作為模板，進行不對稱PCR擴增，所得產(chǎn)物制備成靶物，并與陽性質(zhì)控按照10：3

5、的比例純化后標記CY3，分別與cDNA芯片探針置55℃雜交爐過夜雜交，雜交后洗滌，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Genepix4000A掃描儀讀取。實驗結(jié)果，用8對特異性引物對這8種病原核酸進行不對稱PCR擴增，所擴增的產(chǎn)物作為靶物均可以特異地與制備好的cDNA芯片探針結(jié)合，綠色熒光信號清晰可見，背景值均一，即試驗中設(shè)計的8種病原芯片探針可以特異地檢測這8種病原；檢測敏感性比普通PCR高；批內(nèi)、批間試驗證實應(yīng)用cDNA芯片檢測這8種病原具有較好的穩(wěn)定性。實