1、在本實(shí)驗(yàn)室前期錳營(yíng)養(yǎng)研究成果的基礎(chǔ)上，本論文共進(jìn)行四個(gè)試驗(yàn)，采用原位結(jié)扎灌注腸段法和自然飼喂法，通過(guò)錳吸收動(dòng)力學(xué)和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)研究有機(jī)與無(wú)機(jī)態(tài)錳在肉雞小腸中的吸收機(jī)理。 試驗(yàn)一 為了研究肉雞小腸各段中不同形態(tài)錳吸收機(jī)理的差異，成功克隆獲得了雞小腸DMT1全長(zhǎng)cDNAs序列。雞二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalentmetaltransporter1，DMT1)在動(dòng)物胃腸道錳吸收過(guò)程中起重要作用。 本研究根

2、據(jù)哺乳動(dòng)物DMT1同源蛋白氨基酸序列的保守性設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用3’RACE(rapidamplificationofcDNAends)技術(shù)，擴(kuò)增并克隆獲得雞小腸DMT1cDNA3’端1289bp和1092bp兩種片段，且發(fā)現(xiàn)其3’端翻譯區(qū)和非翻譯區(qū)存在差異。再根據(jù)雞DMTcDNA3’端片段的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得一個(gè)與3’端片段部分重疊的雞DMT1cDNA5’端907bp片段，并對(duì)其進(jìn)行了克隆測(cè)序。 最后根據(jù)雞小腸DMT13’R

3、ACE片段和5’RACE片段序列信息進(jìn)行拼接，從而獲得雞小腸DMT1cDNAs的全序列信息。研究結(jié)果表明，雞小腸DMT1cDNA有兩種形式，一種全長(zhǎng)為1972個(gè)核苷酸，其中5’非翻譯區(qū)104個(gè)核苷酸，編碼區(qū)1695個(gè)核苷酸，3’非翻譯區(qū)173個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)長(zhǎng)564個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；另一種全長(zhǎng)為1775個(gè)核苷酸，其中5’非翻譯區(qū)104個(gè)核苷酸，編碼區(qū)1593個(gè)核苷酸，3’非翻譯區(qū)78個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)長(zhǎng)530個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

4、由兩種形式DMT1cDNA推測(cè)獲得的DMT1蛋白分子量分別為61.56kDa和57.90kDa；等電點(diǎn)分別為5.51和5.75。 對(duì)推測(cè)氨基酸序列進(jìn)行疏水性和跨膜區(qū)分析表明，DMT1蛋白是一種跨膜整合蛋白，具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白糖基化位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)的保守序列。兩種推測(cè)的DMT1蛋白都具有12個(gè)跨膜區(qū)和三個(gè)糖基化位點(diǎn)，且有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)(332-335；345-348)位于DMT1蛋白的第7和第8跨膜區(qū)之間。DMT1cDNA第一種形式

5、推導(dǎo)蛋白序列與已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列進(jìn)行比較，分別有80％、82％，、82％和78％的同源性；DMT1cDNA第二種形式推導(dǎo)蛋白序列與已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列進(jìn)行比較，分別有83％、84％、84％和81％的同源性。 最后根據(jù)雞DMT1cDNA的全序列信息，合成代表雞DMT1cDNA3’最末端的新引物，運(yùn)用末端PCR(End-to-EndPCR)方法，直接從3’

6、末端cDNA庫(kù)體外擴(kuò)增雞小腸DMT1cDNA的拷貝。該全長(zhǎng)cDNA拷貝被克隆進(jìn)T載體，鑒定結(jié)果證明，已成功構(gòu)建了雞小腸DMT1正向和反向的全長(zhǎng)cDNA克隆，為進(jìn)一步研究肉仔雞小腸各段中錳的吸收機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 試驗(yàn)二 用半體內(nèi)原位結(jié)扎灌注腸段法研究快速生長(zhǎng)肉仔雞十二指腸、空腸和回腸中無(wú)機(jī)錳吸收機(jī)理的差異。共包括2個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)1通過(guò)結(jié)扎肉仔雞小腸各段在灌注后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)無(wú)機(jī)錳吸收率的變化來(lái)確定研究結(jié)扎肉仔雞小腸各段錳吸收動(dòng)力

7、學(xué)的采樣時(shí)間；試驗(yàn)2通過(guò)結(jié)扎肉仔雞小腸各段中錳吸收速率隨錳濃度的變化曲線來(lái)比較無(wú)機(jī)錳在肉雞小腸各段中吸收機(jī)制的差異，并通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1mRNA的表達(dá)來(lái)研究其在結(jié)扎肉雞小腸各段錳轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。試驗(yàn)1采用單因子的完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)灌注后5、15、30和40分鐘4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)處理組。由于可從每個(gè)灌注腸段于以上4個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)取樣，故4個(gè)處理組共用同一組雞只。加錳灌注液中以硫酸錳添加2.18mmol/L，(即120ug/ml)錳。將12

8、只28日齡的肉仔雞按體重隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞(為扣除內(nèi)源影響，其中一只雞作為零添加錳水平處理)，每只雞的十二指腸、空腸和回腸分別用作相應(yīng)部位灌注腸段的一個(gè)重復(fù)，故每個(gè)采樣點(diǎn)共有6個(gè)重復(fù)觀測(cè)值。試驗(yàn)2采用單因子的完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)8個(gè)處理組，分別為0、0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74mmol/L錳濃度組。結(jié)扎小腸各段中灌注液的采樣時(shí)間為灌注后5分鐘，結(jié)扎小腸各段小腸粘膜的采樣時(shí)間為灌注后

9、30分鐘。將80只28日齡的肉仔公雞分別按體重隨機(jī)分成8個(gè)處理組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞，每只雞的十二指腸、空腸和回腸分別用作相應(yīng)部位灌注腸段的一個(gè)重復(fù)，故每個(gè)腸段有10個(gè)重復(fù)觀測(cè)值。 試驗(yàn)三 通過(guò)結(jié)扎肉仔雞十二指腸中不同形態(tài)錳吸收的動(dòng)力學(xué)曲線來(lái)比較不同形態(tài)錳在肉仔雞小腸中的吸收機(jī)制，并通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1mRNA的表達(dá)來(lái)研究不同形態(tài)錳在結(jié)扎肉雞小腸中吸收機(jī)理的差異。本試驗(yàn)采用3(錳源)×7(水平)的兩因子的完

10、全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。灌注液中添加的3種錳源分別為無(wú)機(jī)硫酸錳、本實(shí)驗(yàn)室前期采集的強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳(Qf=186，錳含量為10.18％)和中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳(Qf=16.85，錳含量為9.06％)；灌注液中添加錳的濃度分別為0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74mmol/L；同時(shí)設(shè)置不添加錳對(duì)照組，共22個(gè)處理。灌注時(shí)間為30分鐘內(nèi)，肉仔雞結(jié)扎十二指腸對(duì)錳的吸收隨著灌注時(shí)間直線上升，故選取灌注后30分鐘研究結(jié)扎肉仔

11、雞十二指腸對(duì)不同形態(tài)錳的吸收動(dòng)力學(xué)。將220只28日齡體重相近的AA肉公雞隨機(jī)分到22個(gè)處理組中，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞，故每個(gè)腸段有10個(gè)重復(fù)觀測(cè)值。 試驗(yàn)四 通過(guò)比較肝門靜脈血漿中的錳含量來(lái)研究不同形態(tài)錳在肉仔雞小腸中的吸收差異；通過(guò)不同形態(tài)錳對(duì)肉仔雞小腸各段中DMT1mRNA水平的影響揭示不同形態(tài)錳在肉仔雞小腸中吸收機(jī)理的差異。試驗(yàn)采用單因子的完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)4個(gè)處理組，分別為：零添加錳水平對(duì)照組、硫

12、酸錳組、本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用的中等絡(luò)合強(qiáng)度(Qf=16.85；Mn-AAB)和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度(Qf=186；BioplexMn)有機(jī)錳組。將256只14日齡缺錳AA肉公雞按體重隨機(jī)分到以上4個(gè)處理組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞。 結(jié)果表明： (1)在試驗(yàn)的第7天和第14天，肝門靜脈血漿錳含量均受到添加錳源的顯著影響(P＜0.0001)。在第7天，無(wú)機(jī)硫酸錳、中等和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組分別比對(duì)照組肉仔雞的血漿錳含量增加了59.7％

13、(P=0.0029)、112.4％(P＜0.0001)和133.1％(P＜0.0001)。中等和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組比無(wú)機(jī)硫酸錳組分別增加了32.9％(P=0.0075)和45.9％(P=0.0004)。強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳源處理組比中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳源處理組增加了9.7％，但差異不顯著(P=0.2669)。在試驗(yàn)的第14天，無(wú)機(jī)硫酸錳、中等和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組分別比對(duì)照組肉仔雞的血漿錳含量增加了31.0％(P=0.0184)、78.3％(P

14、＜0.0001)和128.6％(P＜0.0001)。中等和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組比無(wú)機(jī)硫酸錳組增加了36.1％(P＜0.0001)和74.5％(P＜0.0001)。強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組比中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)錳組增加了28.2％(P=0.0004)。 (2)肉仔雞十二指腸和空腸中總DMT1mRNA水平極顯著(P＜0.01)高于回腸，十二指腸中總DMT1mRNA水平極顯著(P＜0.01)高于空腸。與對(duì)照組相比，添加不同形態(tài)錳顯著增加了肉仔雞十

15、二指腸和空腸中總DMT1mRNA水平(P＜0.0001)：而對(duì)回腸中總DMT1mRNA水平無(wú)顯著影響(P=0.1793)。 綜上所述，無(wú)機(jī)錳在肉仔雞十二指腸和空腸中主要以飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)方式吸收，而在回腸中主要以非飽和擴(kuò)散的方式吸收。錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1主要在肉雞十二指腸和空腸中表達(dá)，而回腸中很低，提示其在肉雞十二指腸和空腸錳的載體轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用。絡(luò)合(螯合)有機(jī)錳在肉雞十二指腸中主要是以飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)的方式吸收；中等和強(qiáng)絡(luò)合強(qiáng)度