1、木霉（Trichoderma.SPP）屬于半知菌類叢梗孢目，叢梗孢科真菌（Gloiosporae）是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌，對多種植物病原真菌具有拮抗作用。因而被當作為一種生防菌種進行使用，并引起了眾多微生物學家和植物病害研究者的高度重視。一方面鑒于它能促進作物生長，另一方面因頻繁的生化作用的不穩(wěn)定性，迫使人們?nèi)ヌ骄吭?，以促進木霉菌在植物生防領(lǐng)域和促作物生長上的開發(fā)利用，為實現(xiàn)促進木霉在生產(chǎn)應用上提供充分的生物

2、學依據(jù)。幾丁質(zhì)是自然界廣泛存在的生物多聚體，是構(gòu)成大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，而有些微生物分泌的幾丁質(zhì)酶有降解幾丁質(zhì)的作用，而達到防治真菌的目的。很多年來，農(nóng)業(yè)和林業(yè)上遇到的病害很大部分都是由昆蟲和真菌引起的，不難發(fā)現(xiàn)，這兩大類有個重要的共同點，就是其外殼都是由幾丁質(zhì)組成的。所以，在發(fā)現(xiàn)了化學農(nóng)藥對環(huán)境和人類造成的不可彌補的重大災難后，人們把注意力朝向了生物防治，因而催化幾丁質(zhì)分解的主要酶--幾丁質(zhì)酶就自然地成了研究的重點。因此，不斷去

3、尋找篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，并純化其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，研究其性質(zhì)、作用方式、作用效果及分子機理，以及轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物的研究發(fā)現(xiàn)，是目前生物防治研究中的一個新的熱點。
　　 本項研究主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.離子注入并篩選突變菌株：通過氮離子注入誘變哈茨木霉野生菌，再以透明圈法進行平板培養(yǎng)菌的初篩和復篩，DNS法測定液體培養(yǎng)菌的酶活，從中篩選出一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株（編號為3.3），確定為哈茨木霉新突變株（命名待定

4、）。
　　 2.優(yōu)化篩選木霉菌株生長條件：對所篩菌株進行單因素和正交試驗發(fā)酵的條件優(yōu)化。單因素分別是從培養(yǎng)基氮源、膠體幾丁質(zhì)濃度、發(fā)酵起始pH值、培養(yǎng)時間等方面進行，實驗結(jié)果表明，添加1％蛋白胨組的產(chǎn)酶量最高，1.0％膠體幾丁質(zhì)對菌體產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘導性最強，初始pH5.5、培養(yǎng)96h時產(chǎn)酶量較高；正交試驗綜合分析表明，哈茨木霉H-13接種于1％蛋白胨為氮源、0.5％膠體幾丁質(zhì)為碳源、初始pH5.0的培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h時，發(fā)酵液中

5、的幾丁質(zhì)酶活可達到731.69U/mL，高于單因素條件中的任一因素，比野生菌株酶活力提高1倍。
　　 3.對突變菌株幾丁質(zhì)酶基因克?。汗哪久故侵匾纳谰?，對多種病原菌均有很好的拮抗作用，其作用之一就是產(chǎn)生多種細胞壁降解酶，尤其是42kD幾丁質(zhì)酶。根據(jù)GenBank上已有的42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因序列設計適宜的引物，通過PCR技術(shù)，從哈茨木霉H-13基因組DNA中擴增到相應序列，通過GenBank進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該序列同已發(fā)

6、表的其他Trichoderm harzianum42kD幾丁質(zhì)酶序列具有99％的同源性，因此確定該序列為42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因，堿基序列比對表明在編碼區(qū)內(nèi)有11處堿基改變，導致6處氨基酸發(fā)生改變。
　　 4.進行了對所篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)物的應用：在蚌埠懷遠所進行了大棚蔬菜種植實驗，其萵筍、番茄增長30％以上，水稻育秧狀況表現(xiàn)出較對照組的明顯旺盛。
　　 綜上可知，本研究首次采用離子注入誘變的方法并獲得高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的木霉菌株