1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓、環(huán)病毒屬成員，可分為PCV1和PCV2兩個血清型。PCV1無致病性，廣泛存在于豬體及豬源細胞系內(nèi)；PCV2有致病性，是引起斷乳豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原之一。PMWS是繼繁殖與呼吸綜合征之后出現(xiàn)的又一豬免疫抑制性疾病，自1991年加拿大首次報道以來，PMWS迅速在許多國家發(fā)生流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，已引起世界各國的廣泛重視，我國也有PMWS流

2、行和病毒分離的報道。PCV2除引起PMWS，還與豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性腦震顫(CT)等相關，PCV2的感染已嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。據(jù)臨床報告及相關實驗室檢測，山東省也有一定量PCV2感染，并對實際生產(chǎn)造成了嚴重影響。為了進一步了解PCV2在山東省的流行、致病情況，并進一步建立對其感染的快速診斷與檢疫方法，為規(guī)?；i場PCV2的診斷、防治提供科學依據(jù)，我們開展了相關研究。 1.豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離、鑒定及

3、其ORF2基因序列分析 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)基因序列，設計一對PCV2特異性引物。對山東省部分豬場的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的8個自然病例的淋巴結、脾臟組織進行PCR檢測。檢測到陽性病料2份，檢測陽性率為25％，說明該病在山東省已經(jīng)存在。將檢測陽性的病料組織研磨、離心、過濾除菌，接種到無PCV污染的。PK-15細胞進行病毒分離。病毒在PK-15細胞

4、上盲傳4代后，提取病毒DNA，利用PCV2特異性引物對細胞培養(yǎng)物進行PCR檢測，獲得陽性結果，表明PCV2在無PCV污染的PK-15細胞中增殖培養(yǎng)成功。將PK-15細胞增殖所得的病毒樣品處理，在電鏡下可觀察到直徑約為17nm的圓形病毒樣粒子。間接免疫熒光試驗可觀察到PCV2特異性免疫熒光。由此說明，分離出的病毒為豬圓環(huán)病毒2型，并命名為PCV2 SD01和SD02株。 根據(jù)已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2的基因序列，設

5、計一對PCV2的ORF2基因特異性引物，以病料組織和病毒的細胞DNA為模板，對PCV2的ORF2基因進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)一條大小約0.7 kb的特異性目的條帶，與預期目的片段大小相符。利用DNA凝膠快速回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收、測序，結果表明：PCV2SD01和SD02株的ORF2基因序列均由702bp組成，通過比較發(fā)現(xiàn)，分離的SD01和SD02株ORF2基因同源性為99.9％，與其他PCV2毒株ORF2

6、基因的同源性為91.9％-99.4％。 2.豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的原核表達 根據(jù)基因分析，設計一對引物，從克隆的pMD-ORF2重組質(zhì)粒擴增出大小為585bp的部分ORF2基因片段(ORFs)，，克隆到pMD-18T載體中，之后轉(zhuǎn)入表達載體pET-32a，經(jīng)Sail和Xhol酶切鑒定，得到陽性重組表達質(zhì)粒pET-QRFs。將重組質(zhì)粒pET-ORFs轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21中，經(jīng)終濃度為1mmol/L的IPTG

7、誘導，成功表達了ORF2基因編碼的結構蛋白。經(jīng)Western-Blot檢測表明，表達的重組蛋白能夠被PCV2陽性血清所識別，由此說明，重組表達的PCV2部分ORF2蛋白具有良好的反應原性。 豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定、ORF2序列分析，為進一步開展豬圓環(huán)病毒病的病原學、診斷和防制研究莫定了基礎，也為下一步開展的ORF2基因編碼蛋白的生物活性及建立PCV2診斷試劑盒奠定了基礎；豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的原核表達的研究，