1、小麥籽粒硬度是決定小麥磨粉品質(zhì)的最主要因素，能夠影響小麥的終用途及其在國際貿(mào)易中的價格。從分子水平上說，小麥籽粒硬度主要由位于染色體5D上兩個基因Puroindoline a和b（PinA和PinB）所決定，Pin基因的功能研究和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用對小麥品質(zhì)改良具有重要意義。六倍體小麥（AABBDD）由于存在野生型的Pin基因，籽粒通常表現(xiàn)為“軟質(zhì)”。目前愈來愈多的研究推測PINA和PINB在決定籽粒硬度過程中，可能以協(xié)同作用的方式發(fā)揮作用，并

2、且一些最新研究顯示兩者可能存在相互作用。利用RNAi技術(shù)——這種能夠特異性地引起單個基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后水平的沉默的技術(shù)——分別抑制PINA和PINB蛋白的表達(dá)對研究它們的生物學(xué)功能，以及創(chuàng)制六倍體中的硬質(zhì)小麥種質(zhì)都具有重要意義。
　　 本研究在構(gòu)建能夠特異地引發(fā)PinA基因RNAi的載體方面進(jìn)行了探索。RNAi載體所需的元件——能夠反向互補(bǔ)PinA基因正向序列和反向序列以及用于連接兩者的內(nèi)含子——都通過PCR來獲得。在PCR引物設(shè)計

3、中，引入了Bam HⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、SacⅡ四個酶切位點(diǎn)，通過雙酶切按順序?qū)inA基因的正向序列、內(nèi)含子和反向序列連接在一起。然后再通過SmaⅠ和SacⅠ的雙酶切定向的將這個發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到含有Ubi-1啟動子的小麥表達(dá)載體p AHC25中。該RNAi載體在Ubi-1啟動子的驅(qū)動下，廣譜表達(dá)PinA基因的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，從而引起PinA基因的基因沉默。這為利用RNAi技術(shù)研究小麥中PinA、PinB的生物學(xué)功能和它們在影響籽