1、柑橘木虱Diaphorina citriKuwayama是取食植物韌皮部汁液的刺吸式口器昆蟲。柑橘木虱是柑橘黃龍病病菌CandidatusLiberibacter asiaticus唯一的自然傳播媒介。柑橘黃龍病是柑橘毀滅性病害之一，給世界柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。本文以柑橘木虱為研究對(duì)象，利用常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)，從分子生態(tài)學(xué)的角度來研究柑橘-黃龍病病菌-Wolbachia-

2、柑橘木虱互作關(guān)系。本研究通過寄主植物生理狀態(tài)對(duì)柑橘木虱生物學(xué)特性的影響，系統(tǒng)研究了健康與感病砂糖橘對(duì)柑橘木虱適合度的影響；從氨基酸利用的角度分析了黃龍病病菌影響柑橘木虱適合度的營(yíng)養(yǎng)機(jī)制；基于昆蟲內(nèi)共生菌Wolbachia和黃龍病病菌感染與位置分布的相關(guān)性，分析了Wolbachia影響柑橘木虱傳播黃龍病病菌的分子機(jī)制，從而為利用昆蟲內(nèi)共生菌研究柑橘木虱和黃龍病的防控措施提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　1.柑橘木虱的形態(tài)特征

3、　　通過對(duì)柑橘木虱卵和各齡期若蟲形態(tài)特征的觀察，歸納了各相鄰齡期之間的形態(tài)差異。柑橘木虱各齡期若蟲長(zhǎng)寬差距較大：二齡比一齡長(zhǎng)0.145 mm，寬0.166 mm；三齡與二齡間差距分別為0.193 mm和0.182 mm；四齡與三齡差距分別為0.351 mm和0.279 mm；五齡與四齡間差距分別為0.572 mm和0.358 mm。在田間一般可先根據(jù)蟲體大小對(duì)各齡期進(jìn)行初步判定，不確定齡期的再在顯微鏡下進(jìn)一步的確認(rèn)。
　　2.寄主

4、植物對(duì)柑橘木虱生活史的影響
　　柑橘木虱卵、一齡若蟲以及整個(gè)若蟲的發(fā)育歷期受寄主植物的影響較為明顯。在柚子寄主植物上若蟲存活率最高，在黃皮上最低，且兩者差異顯著。寄主植物影響柑橘木虱成蟲壽命，在柚子上的壽命顯著長(zhǎng)于黃皮上的壽命。黃皮上的木虱單雌產(chǎn)卵量顯著低于其他4種寄主。柑橘木虱在九里香上的內(nèi)稟增長(zhǎng)率最高、酸橘上最低；而凈增值率在砂糖橘上最高、黃皮上最低。結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)的5中寄主植物中，除黃龍病隱癥寄主九里香之外，顯癥寄主中砂糖

5、橘是柑橘木虱的最適寄主。
　　3．黃龍病病菌對(duì)柑橘木虱適合度的影響
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，帶菌柑橘木虱或者在感病砂糖橘上取食的柑橘木虱世代發(fā)育歷期均縮短，如卵、若蟲以及卵到成蟲的整個(gè)發(fā)育歷期，均顯著小于健康柑橘木虱在健康砂糖橘上的發(fā)育歷期。但對(duì)于柑橘木虱的存活率來講其變化趨勢(shì)正好和發(fā)育歷期相反，帶菌柑橘木虱在感病砂糖橘上的存活率最低，健康柑橘木虱在健康砂糖橘上最高，健康砂糖橘上柑橘木虱的存活率顯著高于感病砂糖橘上的存活率。感病砂糖橘

6、上柑橘木虱 F1代的單雌平均產(chǎn)卵量顯著高于健康砂糖橘。本研究結(jié)果表明黃龍病病菌有利于柑橘木虱在砂糖橘寄主上的種群增長(zhǎng)。
　　4．黃龍病病菌對(duì)寄主植物及柑橘木虱氨基酸組分的影響
　　當(dāng)砂糖橘感染黃龍病病菌后，韌皮部汁液中各游離氨基酸的組分以及比例均發(fā)生了改變。表明黃龍病病菌對(duì)柑橘木虱的有利影響可能與砂糖橘寄主韌皮部汁液營(yíng)養(yǎng)成分改變有關(guān)。
　　柑橘木虱取食感病砂糖橘時(shí)分泌的蜜露中游離氨基酸天冬酰胺和脯氨酸下降明顯，同時(shí)這兩

7、種氨基酸在感病砂糖橘韌皮部汁液中又明顯增加，說明黃龍病病菌增加了柑橘木虱對(duì)天冬酰胺和脯氨酸的吸收，這可能利于柑橘木虱若蟲發(fā)育。同時(shí)黃龍病病菌增加了柑橘木虱體內(nèi)必需氨基酸的含量，必需氨基酸的增加可能有利于柑橘木虱的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　帶菌柑橘木虱若蟲和健康柑橘木虱若蟲在九里香上分泌的蜜露中游離氨基酸的組分差異很小，表明黃龍病病菌對(duì)柑橘木虱若蟲氨基酸營(yíng)養(yǎng)吸收的影響不大。
　　5．次生共生菌Wolbachia在柑橘木虱體內(nèi)分布及感染動(dòng)

8、態(tài)
　　廣州柑橘木虱種群體內(nèi)7種共生菌的感染率存在差異，Carsonella、Profftella和Wolbachia感染率均是100％；Arsenophonus感染率為51.7%；Rickettsia、Cardinium和Hamiltonella三種共生菌的感染率很低。
　　Wolbachia在柑橘木虱卵、各齡期若蟲及雌雄成蟲體內(nèi)的感染率存在差異。Wolbachia的含量隨著木虱齡期的增加而增多，且雄蟲體內(nèi)Wolbachi

9、a的含量高于雌蟲。Wolbachia在卵中的分布隨著卵的發(fā)育而不斷變化，從卵柄到卵中部再到遠(yuǎn)離卵柄一端，最后在老熟卵體內(nèi)呈現(xiàn)散布型分布。Wolbachia在若蟲體內(nèi)主要集中在含菌體內(nèi)，而在雌雄成蟲體內(nèi)是局限在蟲體腹部。
　　6．黃龍病病菌在柑橘木虱體內(nèi)分布及感染動(dòng)態(tài)
　　初羽化的柑橘木虱成蟲接到感病柑橘樹上，分別在15d、30d、45d以及60d收集不同取食時(shí)間的柑橘木虱進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明柑橘木虱體內(nèi)黃龍病病菌含量在取食15

10、d時(shí)，黃龍病病菌含量達(dá)到最高，此后，隨著取食時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)而減少。而Wolbachia的含量變化趨勢(shì)則是隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
　　利用常規(guī)PCR可以在3-5齡若蟲以及成蟲體內(nèi)檢測(cè)到黃龍病病菌，而qRT-PCR除了3-5齡若蟲外，還可以在二齡若蟲體內(nèi)檢測(cè)到黃龍病病菌，但仍然不能在卵和一齡若蟲體內(nèi)檢測(cè)到。卵和各齡期若蟲中黃龍病病菌的含量是隨著齡期的變大而不斷增多。對(duì)于柑橘木虱的成蟲，在產(chǎn)卵盛期的木虱體內(nèi)黃龍病病菌的含量最高，顯

11、著高于產(chǎn)卵前期以及產(chǎn)卵后期。
　　熒光原位雜交技術(shù)在柑橘木虱卵、1-3齡若蟲體內(nèi)不能檢測(cè)到黃龍病病菌，而在四、五齡若蟲體內(nèi)可以檢測(cè)到黃龍病病菌，病菌主要分布在若蟲的U型含菌體內(nèi)，個(gè)別蟲體在若蟲胸部也有分布。黃龍病病菌在柑橘木虱若蟲中的分布位置與Wolbachia在若蟲的位置相似，表明了在四、五齡若蟲體內(nèi)黃龍病病菌和Wolbachia可在含菌體內(nèi)共生。黃龍病病菌在雌雄成蟲體內(nèi)均是散布型分布，且這種分布形式利于黃龍病病菌的水平傳播。<

12、br>　　概括而言，通過砂糖橘-黃龍病病菌-柑橘木虱互作關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，黃龍病病菌有利于柑橘木虱種群的增長(zhǎng)；黃龍病病菌的感染增加了柑橘木虱對(duì)氨基酸的吸收與利用；另外，柑橘木虱體內(nèi)Wolbachia的感染動(dòng)態(tài)與黃龍病病菌的感染動(dòng)態(tài)均是隨著齡期的變大而增加，且兩者在柑橘木虱若蟲體內(nèi)均分布于含菌體內(nèi)，二者共生關(guān)系可能與柑橘木虱若蟲階段獲菌率高有關(guān)，推測(cè)Wolbachia參與砂糖橘-黃龍病-柑橘木虱三者間的互作來影響柑橘木虱的獲菌率，具體分子機(jī)制