1、<p>　　兔Vx2肝癌改良模型的建立及其DSA影像分析</p><p>　　作者：曹瑋，王執(zhí)民，張洪新，王義清，郭衛(wèi)平，李文獻(xiàn)，倪代會(huì)，梁志會(huì)，齊連君 </p><p><b>　　【關(guān)鍵詞】 兔 </b></p><p>　　關(guān)鍵詞: 兔;肝臟Vx2腫瘤;數(shù)字減影成像 </p><p>　　摘 要:目

2、的 建立可供實(shí)驗(yàn)研究的穩(wěn)定的兔Vx2移植性肝癌模型，探討不同植瘤方式的成功率，并分析該腫瘤的DSA影像特征. 方法 新西蘭白兔60只，隨機(jī)分3組，每組20只.將Vx2瘤細(xì)胞（5×107 個(gè)）經(jīng)肝動(dòng)脈或經(jīng)肝包膜分別接種于2組兔的肝左葉，建立對(duì)照肝癌模型.第3組經(jīng)肝包膜植入瘤組織塊（約含106 ～108 個(gè)瘤細(xì)胞）建立改良肝癌模型.觀察:①不同組植瘤的成活率;②改良組腫瘤7，10，14，17和21d時(shí)的體積（B超測(cè)），并計(jì)算腫

3、瘤生長(zhǎng)率;③大體及鏡下（光鏡和電鏡）瘤組織形態(tài)特征;④改良Vx2移植性肝癌的DSA影像特征. 結(jié)果 3組植瘤成活率分別為7/20，10/20和19/20，改良組植瘤成活率最高（P&lt;0.05），瘤體呈指數(shù)性生長(zhǎng)，組織病理及電鏡表明該瘤在肝組織中浸潤(rùn)式生長(zhǎng)，其形狀與移植于兔其他部位的Vx2鱗狀細(xì)胞癌特征相似.DSA影像示該移植性肝癌具有豐富的血供. 結(jié)論 成功建立了兔Vx2移植性肝癌改良模型，瘤組織塊種植方式成功率明顯高于

4、動(dòng)脈途徑和細(xì)胞液注射方式，為肝癌研究提供了大型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? </p><p>　　Keywords:rabbit;liver Vx2neoplasms;digital substract an-giography </p><p>　　Abstract:AIM To establish suitable metastatic rabbit Vx2 liver tumor model for

5、experimental study，probe into differ-ent tumor transplanted methods and analyze the DSA（digital substract angiography）imagining features of the liver tumor.METHODS 60male New Zealand white rabbits were divid-ed into3grou

6、ps at random，20in each group.5×107 Vx2carcinoma cells were injected via hepatic artery，pecutaneous into liver by syringe needle in the different2groups（control groups）;the3rd group（retrofit group）were </p>&l

7、t;p>　　8 carcinoma cells）into liv-er.Then we observed:①the success rate of implanting tu-mor;②the volume change of tumor by ultrasonograpy（the growth rate of tumor was calculated）;③the biological fea-tures of tumor（his

8、topathology and electronic microscope photographs）;④the DSA imagining features of tumor.RESULTS The success rates of transplanting tumor of3groups were7/20，10/20，19/20;the retrofit group was the highest of3groups（P&l

9、t;0.05）.The tumor grew as exponen-tial curve.Histopathology and electroni</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　原發(fā)性肝癌的介入性治療已成為當(dāng)前綜合治療肝癌的有效手段之一，經(jīng)導(dǎo)管栓塞化療可有效地抑制癌瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)生存期、改善生存質(zhì)量，目前已成為中晚期肝癌的首選治療方

10、案，與近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高溫、冷凍、乙醇注射等新療法一樣，其技術(shù)仍需改進(jìn)，為進(jìn)一步提高療效仍需深入研究.故有效的評(píng)價(jià)新的介入技術(shù)及其治療效果的動(dòng)物模型就顯得猶為重要.目前能夠復(fù)制的肝癌模型如裸鼠，因其個(gè)體體積較小，不能模擬在體肝癌的介入治療情況，故建立可供介入性實(shí)驗(yàn)觀察的肝癌動(dòng)物模型是需解決的問(wèn)題之一.本研究根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立了兔Vx2肝癌改良模型，有效地解決了介入性基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為提高臨床介入治療

11、肝癌的效果，提供了可靠的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù). </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　　新西蘭白兔60只，體質(zhì)量2.5～2.7kg，雌雄各半，由本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供.兔Vx2癌株由日本京都Funabashi Farm公司提供，癌株種類(lèi)為Vx

12、2鱗狀細(xì)胞癌.1250mA，Polydoros-100附帶DSA的大功率X線(xiàn)機(jī)（德國(guó)Siemens公司生產(chǎn)），2/3FMag微導(dǎo)管（Cook公司，頂端自塑形為“C”）. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　取冰凍Vx2瘤細(xì)胞懸液，按一般細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)［1］ 進(jìn)行復(fù)蘇后離心5min（800r min </p><

13、;p>　　-1 ）.除去上清液，加入PBS液用玻璃棒攪勻，取懸液置于RP-MI1640培養(yǎng)液中，按文獻(xiàn)［2］細(xì)胞培養(yǎng)傳代，臺(tái)盼藍(lán)染色，死、活細(xì)胞計(jì)數(shù)，將培養(yǎng)液調(diào)制成1010 個(gè) L-1 活細(xì)胞密度.將新西蘭兔隨機(jī)分為3組，每組20只.第1組:瘤細(xì)胞懸液（5×1010 個(gè) L-1 ）經(jīng)動(dòng)脈注入1.0mL.第2組:瘤細(xì)胞懸液（5×1010 個(gè) L-1 ）經(jīng)肝包膜注入1.0mL.第3組（改良法）:生理鹽水與瘤塊的混懸

14、液約1.0mL經(jīng)肝包膜注入.瘤塊取自兔后腿外側(cè)肌肉接種瘤株2wk后的實(shí)質(zhì)性包塊，切取包塊邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣組織，用眼科剪剪碎，與生理鹽水混懸瘤細(xì)胞約109 ～10 </p><p>　　11 個(gè) L-1 .①兔經(jīng)戊巴比妥鈉（30mg kg-1 ）iv麻醉后，取上腹部正中切開(kāi)腹腔，將兔肝左中央葉充分暴露.挑開(kāi)肝包膜，將懸液用16號(hào)針頭注入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)接種;②將兔麻醉后，置于仰臥位固定，右側(cè)腹股溝備皮消毒后，經(jīng)股動(dòng)脈搏

15、動(dòng)處沿其縱軸切開(kāi)皮膚.鈍性分離暴露右側(cè)股動(dòng)脈，暫時(shí)夾閉近端，用4號(hào)絲線(xiàn)提起遠(yuǎn)端股動(dòng)脈，用眼科剪剪開(kāi)一小斜口，將導(dǎo)管鞘插入固定，隨后導(dǎo)入2/3F微導(dǎo)管，在X線(xiàn)機(jī)透視下，間斷注入600g L-1 復(fù)方泛影葡胺以顯示導(dǎo)管頂端位置，插管至胃肝動(dòng)脈接種及行DSA（數(shù)字減影）［3-6］ .觀察指標(biāo):①觀察不同接種途徑的成功率;②利用B超監(jiān)測(cè)腫瘤在7，10，14，17和21d時(shí)的體積變化（V=0.5a×b2 ，a和b分別是最大和最小直徑），

16、并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)率（tumor growth rate，TGR）;③瘤組織大體及鏡下形態(tài)學(xué)觀察;④兔Vx2移植性肝癌的DSA影像特征. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:Student’s t test，Mann-Whitney U test，P&lt;0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p

17、>　　2.1 接種成功率 </p><p>　　肝實(shí)質(zhì)瘤塊移植組成功率（19/20）最高，與經(jīng)胃肝動(dòng)脈注射組植瘤成功率（7/20）比較差別顯著（P&lt;0.01），與肝實(shí)質(zhì)直接注射瘤細(xì)胞組成功率（10/20）比較差別顯著（P&lt;0.05）. </p><p>　　2.2 腫瘤生長(zhǎng)參數(shù) </p><p>　　接種17d的腫瘤體積、直

18、徑較前增長(zhǎng)迅速，TGR為93.9%，與前比較差別有顯著性（P&lt;0.05），接種21d的腫瘤體積、直徑較前增長(zhǎng)緩慢，TGR為60.6%，與前比較差別無(wú)顯著性（P&gt;0.05，Tab1）.腫瘤體積、直徑呈指數(shù)性生長(zhǎng)，在接種17d后生長(zhǎng)迅速，腫瘤體積增長(zhǎng)快于直徑增長(zhǎng)（Fig1）.表1 不同接種時(shí)間的腫瘤體積、腫瘤直徑及生長(zhǎng)率（略） </p><p>　　2.3 腫瘤形態(tài)學(xué) </p&g

19、t;<p>　　處死荷瘤兔，剖腹見(jiàn)腫瘤在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)呈圓形，結(jié)節(jié)狀，無(wú)包膜.腫瘤結(jié)節(jié)呈灰白色，魚(yú)肉樣，質(zhì)硬，其內(nèi)可見(jiàn)豐富的供瘤血管（Fig2（略））.低倍鏡下（Fig3A（略））可見(jiàn)肝內(nèi)浸潤(rùn)性癌巢，與肝實(shí)質(zhì)無(wú)明顯邊界，間質(zhì)分界不清，結(jié)締組織較少，癌巢邊緣分布著被浸潤(rùn)的肝索結(jié)構(gòu).腫瘤細(xì)胞彌散排列，可見(jiàn)纖維間隔，新生毛細(xì)血管豐富.高倍鏡下（Fig3B（略））見(jiàn)瘤細(xì)胞體積大，形態(tài)不規(guī)則，呈不規(guī)則排列.胞質(zhì)豐富，淡紅染色.核肥大，其大

20、小及形態(tài)各異，染色濃淡不均，核分裂像多見(jiàn). </p><p>　　電鏡（Fig4（略））:可見(jiàn)瘤細(xì)胞呈多形性，大小不等，常見(jiàn)分裂相.細(xì)胞間連接較松散，偶見(jiàn)橋粒.細(xì)胞表面有許多短小微絨毛伸入到相鄰的細(xì)胞間隙.核大畸形，核膜清楚，常染色質(zhì)豐富，染色顆粒較粗，核仁明顯，可見(jiàn)多個(gè)核仁.胞質(zhì)內(nèi)有豐富的游離核蛋白體，散在的線(xiàn)粒體，高爾基復(fù)合體及分泌顆粒，并可見(jiàn)成束的張力原纖維，提示為中分化鱗癌. </p>&

21、lt;p>　　2.4 腫瘤DSA影像特征 </p><p>　　經(jīng)微導(dǎo)管注入適量造影劑后，胃肝動(dòng)脈顯影良好，胃的輪廓及胃底動(dòng)脈清晰顯示（Fig5）.肝的輪廓顯示良好，肝實(shí)質(zhì)造影劑濃密，肝內(nèi)動(dòng)脈分支顯影欠清晰.箭頭所示為兩個(gè)瘤染色區(qū)，造影劑淺淡，其周?chē)梢?jiàn)粗大的供瘤動(dòng)脈，染色濃，走行分支清晰，被瘤體推壓成“抱球狀”，瘤區(qū)內(nèi)部可見(jiàn)網(wǎng)片狀瘤染色. </p><p><b>　

22、　3 討論 </b></p><p>　　3.1 Vx2瘤生長(zhǎng)特性 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瘤株于肝臟成活后呈指數(shù)性生長(zhǎng)，2～3wk生長(zhǎng)最旺盛，其體積迅速增大，切面呈實(shí)質(zhì)性，中心無(wú)變性壞死.此階段為供瘤血管形成期［7，8］ ，毛細(xì)血管大量形成，供養(yǎng)豐富.4wk后腫瘤中心出現(xiàn)變性壞死灶，并有肺和腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，此階段為供瘤血管穩(wěn)定期［7，8］ ，瘤體增長(zhǎng)快于血管

23、增生，瘤中心因缺血而壞死.6～7wk腫瘤中心呈大片液化壞死灶并形成囊腔.此階段為供瘤血管退化期［7，8］ ，血管增生相對(duì)減緩，瘤體大部壞死.故進(jìn)行腫瘤傳代、模型制作及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，不宜太晚，一般以4wk為宜，以免因腫瘤壞死和轉(zhuǎn)移影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果. </p><p>　　3.2 Vx2瘤移植途徑 </p><p>　　目前Vx2瘤株在體成瘤率仍很低，如何提高植瘤成功率，是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn).我們

24、回顧了國(guó)外的文獻(xiàn)，對(duì)不同移植途徑做一比較，證實(shí)瘤塊移植成瘤率高.瘤細(xì)胞在體種植如同種子與土壤，其成活依賴(lài)兩個(gè)條件:①濃度.②環(huán)境.瘤細(xì)胞濃度最好在109 個(gè) L-1 以上［9］ ，接種部位血供充足如肌肉、肝臟等.本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)脈種植組，瘤細(xì)胞濃度易被血液稀釋?zhuān)_(dá)肝實(shí)質(zhì)時(shí)濃度進(jìn)一步降低，故成瘤率較低（7/20）.經(jīng)皮局部種植組，瘤細(xì)胞的生存適應(yīng)期與機(jī)體免疫力成負(fù)相關(guān)，其濃度與血供營(yíng)養(yǎng)的需求成正相關(guān)，故成瘤率仍低（10/20）.瘤塊移植組，保證

25、了瘤細(xì)胞正常生長(zhǎng)的濃度，組織塊成為瘤細(xì)胞抵御機(jī)體免疫力的屏障，延緩了清除過(guò)程，增強(qiáng)了對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)力，故成瘤率高（19/20）. </p><p>　　3.3 Vx2肝癌的DSA影像特征 </p><p>　　兔血管較細(xì)，所容納造影劑的體積很?。?0］ ，在一般X線(xiàn)機(jī)透視下難以顯示肝動(dòng)脈的次級(jí)分支和血管形態(tài)或腫瘤實(shí)質(zhì)染色現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)示兔肝實(shí)質(zhì)顯影良好，但血管走行及分支顯影欠清晰.腫瘤血

26、管密度與接種部位有一定的關(guān)系［11］ ，一般接種于肌肉，肝臟和腎臟的Vx2腫瘤血管密度較高.本改良Vx2肝癌為血供豐富的實(shí)體瘤，其外周可見(jiàn)由肝動(dòng)脈分出的腫瘤滋養(yǎng)血管抵達(dá)腫瘤并繞行，滋養(yǎng)血管較粗大且血管密度較高，其分支深入腫瘤內(nèi)部，通過(guò)供瘤血管可勾畫(huà)出腫瘤的輪廓. 3.4 改良Vx2肝癌模型的建立及意義 本瘤株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，是一種可移植的瘤株，可制成兔原位腫瘤動(dòng)物模型［12］ .本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［13-1

27、5］進(jìn)行改良，采用瘤塊注射法復(fù)制出的Vx2兔肝癌模型，經(jīng)腫瘤形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)，與Vx2瘤株在兔其他部位移植的腫瘤性狀相似，且具有肝癌的特性，為中分化鱗癌.本改良模型具有接種方法簡(jiǎn)單、成功率高、重復(fù)性好、模型性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其血供主要來(lái)自肝動(dòng)脈，且血供豐富，雖其組織形態(tài)、生物學(xué)特性與原發(fā)性肝癌有所不同，但可用作有關(guān)肝癌治療學(xué)及肝癌影像學(xué)等的臨床前期研究.本模型對(duì)臨床評(píng)價(jià)各種</p><p><b>

28、;　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Yan HF，F(xiàn)u WJ，Ren WL.The transplanted animal tumor cells freeze to survive and resuscitation ［J］.Yiyao Gongye（Chin J Pharm），1986;17（10）:28-29. </p><p>　　［2］Prat F，

29、Centarti M，Sibille A，Henry L，Chapelon JY，Cathignol D.Extracorporeal high-intensity ultrasound for Vx2liver tu-mors in the rabbit ［J］.Hepatology，1995;21（3）:832-836. </p><p>　?。?］Chen ZH，Wang ZM，Wu DC，Xu SD，Ch

30、en HW，Wen AD.Early dynamical body distribution of nanoparticle-associated adri-amycin after administration into the hepatic artery of rats deter-mined with HPLC technique ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Uni

31、v），2000;21（1）:89-91. </p><p>　?。?］Liang ZH，Wang ZM，Zhang HX，Qi LJ，Guo WP，Wang YQ，Ni DH，Guan Y，Li WX.Effect of interventional thermotherapy through hepatic artery on liver function in dogs ［J］.Di-si Junyi Dax

32、ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）: </p><p>　　430-432. </p><p>　　［5］Zhang HX，Liu Y，Guo WP，Li WX，Gao W，Cao W，Liang ZH，Ni DH.Cytotoxic effect of adriamycin hyperthermia on rab-bit carcin

33、oma cell line VX2in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（12）:1457-1460. </p><p>　?。?］Wang ZM，Xu SD，Zhu RF，Guan Y，Li LC.Digital subtrac-tion angiography observation on clinical s

34、ignificance of hemody-namical changes in the mid and late period of primary hepatoma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1993;14（6）:430-435. </p><p>　?。?］Hanahan D，F(xiàn)olkman J.Patterns and emer

35、ging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis ［J］.Cell，1996;86（3）:353-364. </p><p>　?。?］Morgon J，Pake H.Metastases:mechanisms，pathways and cas-cades ［J］.AJR，1995;164（5）:1075-1082. </p>

36、<p>　　［9］Swistel AJ，Bading JR，Raaf JH.Intraarterial versus intravenous Adriamycin in the rabbit Vx2tumor system ［J］.Cancer，1984;53（6）:1397-1404. </p><p>　?。?0］Girard MS，Baker KG，Steinbach GC，Deiranieh

37、LH，Peterson TM，Mattrey RF.Assessment of liver and kidney enhancement with a perfluorocarbon vapor-stabilized US contrast agent ［J］.Acad Radiol，1999;6（5）:273-281. </p><p>　?。?1］Leander T，Harada T，Yuri Y，Besja

38、kov J.CT and MR imaging of the liver using liver specific contrast media.A comparative study in a tumor model ［J］.Acta Radiol，1996;37（3）:242-249. </p><p>　?。?2］Eda I，Soga H，Ueoka M，Okada A，Yamashita K，Shimiz

39、u N.The suppression of postoperative liver metastasis caused by the continuous intraportal infusion of angiogenesis inhibitor FR-118487in a rabbit colon cancer model ［J］.Surg Today，1998;28（3）:273-278. </p><p&g

40、t;　?。?3］Okada M，Kudo S，Miyazaki O，Saino T，Ekimoto H，Iguchi H，Hirano S，Kuboki H，Kadosawa H，Takeuchi T.Antitu-moral efficacy and pharmacokinetic preperties of pirarubicin upon hepatic intra-arterial injection on the rabbit

41、 Vx2tumor model ［J］.Br J Cancer，1995;71（3）:518-524. </p><p>　　［14］Tanaka H，Taniguchi T，Mugitani Y，Koishi Y，Masuyama M，Higashida T，Koyama H，Suganuma Y，Miyata K，Takeuchi K.Intraarterial administration of the a

42、ngiogenesis inhibitor TNP-470blocks liver metastasis in a rabbit model ［J］.Br J Cancer，1995;72（3）:650-653. </p><p>　　［15］Zhao ZX，Du JH，Wang XH，Qian XM.Pharmacokinetic study of intraarterial hepatic pirarubic