1、<p>　　山莨菪堿對脂多糖結合血管內皮細胞及誘導NO合成的抑制作用</p><p>　　【關鍵詞】 山莨菪堿 </p><p>　　關鍵詞: 山莨菪堿;內皮，血管;脂多糖類;一氧化氮 </p><p>　　摘 要:目的 實驗觀察山莨菪堿對細菌脂多糖（LPS）結合血管內皮細胞膜及誘導NO生成的影響. 方法 體外分離培養(yǎng)牛主動脈血管內皮細胞，用免疫組

2、化顯色反應顯示細菌脂多糖與血管內皮細胞的結合，并通過圖像分析對結果進行半定量;用高壓液相色譜分析細胞培養(yǎng)液中NO </p><p>　　3- 的含量，間接反應NO的生成水平. 結果 細胞分組處理，間接法顯色后圖像分析，結果表明山莨菪堿組的平均灰度值明顯低于LPS組（P&lt;0.05）;并且對細胞培養(yǎng)液中NO </p><p>　　3- 的檢測顯示山莨菪堿組的濃度明顯低于LPS組

3、（P&lt;0.05）. 結論 山莨菪堿能夠抑制LPS結合血管內皮細胞，并且能夠抑制LPS對NO合成的誘導作用. </p><p>　　Keywords:anisodamine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitric oxide </p><p>　　Abstract:AIM To investigate the effe

4、ct of anisodamine on lipopolysaccharides attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of nitric oxide（NO）.METHODS The bovine aortic endothelial cells（BAEC）were isolated and cultured for study.The li

5、popolysaccharides（LPS）at-tached to the membrane of endothelium was detected by im-munocytochemistric means.The NO 3- level which reflected the releasing of NO in culture medium was determined by high-performance liquid c

6、hromatography.RESULTS Af</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　研究與臨床實踐證明大劑量的山莨菪堿對于搶救內毒素休克有效，其研究的結果表明其抗休克的作用機制主要在細胞水平上.近年對大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）識別結合細胞膜上受體，引發(fā)各種病理生理過程的研究日漸深入.本實驗旨在通過

7、體外培養(yǎng)血管內皮細胞，觀察山莨菪堿對LPS結合血管內皮細胞膜上受體以及誘導NO合成的影響，以此進一步揭示山莨菪堿抗內毒素休克的作用機制. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　?、偎幤放c試劑:Ⅰ型膠原酶;正辛胺（n-octylamin

8、e）;大腸桿菌脂多糖E.coil O11B4（lipopolysaccharides，LPS，美國Sigma公司）;RPMT-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;抗LPS單克隆抗體參照馬越云等［1］ 建立的方法制備;Ⅷ因子相關抗原抗體與CD14單克隆抗體（武漢博士德生物技術公司）;辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG抗體（華美生物工程公司）;鹽酸消旋山莨菪堿（蕪湖長江藥業(yè)有限公司產品，批號9806192）.地塞米松（天津藥業(yè)有

9、限公司）;②儀器設備:高壓液相色譜儀（美國Beckman公司）;CMIAS系列-多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學圖像中心）. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　?、偌毎囵B(yǎng)與鑒定:無菌條件下取牛主動脈血管10～15cm，管腔注入1g L-1 Ⅰ型膠原酶，37℃消化20min，收集消化液，離心洗滌細胞2次，計數(shù)，以1

10、×108 L-1 細胞數(shù)接種于含200g L-1 小牛血清的1640培養(yǎng)液，5mL L-1 CO 2 ，37℃條件下培養(yǎng)，胰酶消化傳代，實驗用6～10代細胞.培養(yǎng)細胞用Ⅷ因子相關抗原單克隆抗體檢測呈陽性;②內皮細胞膜結合:LPS-sCD14復合物的檢測細胞均勻爬片，每8張一組，分4組:空白對照組，LPS組，山莨菪堿組，CD14抗體組.其中山莨菪堿組含山莨菪堿25mg L-1 ;CD14抗體組含抗CD14單克隆抗體3mg L-

11、1 .;除空白對照組以外，各組的培養(yǎng)液中均含LPS1.0mg L-1 .藥物在含200g L-1 小牛血清的1640培養(yǎng)液中作用4h后，40g L-1 中型甲醛固定細胞，抗LPS單克隆抗體（50mg L-1 ）檢測結合于細胞膜上的LPS，用間接法進行免疫組化染色，由辣根過氧化物酶-DAB系統(tǒng)顯色.在CMIAS系列-多功能彩色病理圖像分析儀上進行計算機輔助圖像分析;③細胞培養(yǎng)液的處理:細胞以2×10 5 /孔濃度均</p&

12、gt;<p><b>　　2 結果 </b></p><p>　　2.1 山莨菪堿對LPS結合血管內皮細胞的影響 </p><p>　　在CMIAS系列-多功能彩色病理圖象分析儀上，200倍視野下，每張片子分別隨機觀察記錄1個視野，記錄所測細胞的平均灰度值.灰度單位分為256個等級，LPS與血管內皮細胞的結合量與灰度值呈反比關系（Fig1（略））.

13、 </p><p>　　2.2 山莨菪堿對LPS誘導血管內皮細胞NO合成的影響 </p><p>　　NO的半衰期極短，很快被氧化為NO2- /NO3- ，并且NO2- 可進一步氧化為NO3- （Tab1）. 表1 不同實驗組的細胞培養(yǎng)液中NO（略） </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>

14、　　G- 細菌引起感染性休克的主要致病因素為其菌體的LPS，進入體內后與血漿中的LBP蛋白、sCD14蛋白結合形成LPS-sCD14復合物，以復合物的形式與內皮細胞膜上相應受體結合［3］ ，其中sCD14蛋白在LPS與其膜受體結合的過程中起關鍵性作用.相應的CD14單克隆抗體可以有效的抑制LPS與其膜受體結合、誘導一系列的細胞反應［4］ .本實驗中山莨菪堿表現(xiàn)了與CD14單克隆抗體類似的作用，能夠抑制LPS-sCD14復合物與血管內皮細

15、胞的結合.LPS結合血管內皮細胞可誘導其合成釋放大量的NO，使血管平滑肌的K+ 離子通道開放，平滑肌舒張，血壓下降，并使血管對兒茶酚胺的反應性降低，這是造成內毒素休克患者持續(xù)性低血壓的重要原因［5，6］ .實際上，用地塞米松、NG- 單甲基-L-精氨酸（L-NMMA）等藥物阻斷NO的生成可以明顯的改善內毒素休克動物的持續(xù)低血壓狀態(tài)［7］ .山莨菪堿阻礙LPS-sCD14復合物與血管內皮細胞的結合必然對LPS誘導的NO生成具有抑制作用，從

16、而對內毒素休克時的持續(xù)低血壓狀態(tài)起到改善作用，相應的CD14單克隆抗體也在實驗中證明有相同的作用［8］ .由此實驗我們認為，</p><p><b>　　參考文獻: </b></p><p>　?。?］Ma YY，Ding ZR，Yu WB，Su MQ，Mu SJ.Cross-reactivities of Monocolonal antibodies against

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