1、<p>　　水楊酸鈉給藥對(duì)小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表達(dá)的影響</p><p>　　作者：尹時(shí)華，龔樹生，鄢開勝，李穗，陳沛，陳廣理 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 水楊酸鈉 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To study the effects of sodium salicylate on the expressio

2、n of NGB mRNA and protein in inferior colliculus neurons in mice. METHODS: Fortyeight Kunming mice were divided into four groups: control group (A) ［200 mg/(kg&#12539;d)］, ［300 mg/(kg&#12539;d)］, and ［450 mg/(kg

3、&#12539;d)］ sodium salicylate administrated groups (B, C, D). The expression of NGB mRNA was measured by using RTPCR and the protein expression of NGB was measured by WesternBlot. RESULTS: The expression of NGB mR&l

4、t;/p><p>　　【Keywords】 sodium salicylate；mice；nucleus of inferior colliculus； neuroglobin </p><p>　　【摘要】 目的： 觀察水楊酸鈉給藥對(duì)小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表達(dá)的影響. 方法： 成年健康昆明小鼠48只分為A，B，C，D四組，每組12只. A為對(duì)照組，B，C，D分別為水楊酸鈉200,

5、300和450 mg/(kg&#12539;d)給藥組. 給藥15 d后處死檢測(cè)；采用RTPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)NGB mRNA的表達(dá)；WesternBlot分析NGB蛋白表達(dá). 結(jié)果： ①對(duì)照組小鼠下丘核區(qū)NGB mRNA表達(dá)明顯高于三個(gè)水楊酸鈉給藥組（P&lt;0.01）；三個(gè)水楊酸鈉給藥組NGB mRNA表達(dá)比較以D組表達(dá)最低，B組表達(dá)最高，C組與D組比較有顯著性差異（P&lt;0.05）. ②West

6、ernBlot檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)各組均表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為17 000的NGB蛋白. A組NGB蛋白表達(dá)明顯高于其他各組；三個(gè)水楊酸鈉給藥組以B組表達(dá)最高D組表達(dá)最低. 結(jié)論：水楊酸鈉可顯著降低下丘核神經(jīng)元NGB mRNA和蛋白表達(dá)；水楊酸鈉給藥對(duì)下丘核神經(jīng)元NGB mRNA和蛋白表達(dá)與給藥劑量有關(guān). </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 水楊酸鈉；小鼠；下丘核；腦紅素 </p><p><

7、;b>　　0引言 </b></p><p>　　自從Burmester等［1］首次報(bào)道人和小鼠腦內(nèi)存在特異的功能上類似于肌紅蛋白的攜氧球蛋白腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)以來(lái)，圍繞NGB的研究已在國(guó)際范圍內(nèi)掀起重新認(rèn)識(shí)和研究腦缺氧的熱潮. 下丘核是最重要的聽中樞皮下會(huì)聚站［2］，在聲信號(hào)處理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它在聲音頻率、強(qiáng)度、時(shí)間因素及聲源定位的分析中均起著重要的作用. 水

8、楊酸類藥物抗炎作用的機(jī)制之一是通過(guò)阻斷前列腺素環(huán)氧化酶的活性以抑制花生四烯酸的代謝產(chǎn)物前列腺素類的合成［3,4］. 眾所周知,花生四烯酸是前列腺素類(PGs)和白三烯類(LTs)的前體,而后者是作用于血管的介質(zhì),可影響血管的舒縮功能. 可以推測(cè)，水楊酸鈉可能通過(guò)阻斷前列腺素環(huán)氧化酶的活性減少血管內(nèi)皮擴(kuò)血管介質(zhì)PGI2和PGE2的生成，相應(yīng)刺激縮血管介質(zhì)LTs的合成,從而引起血流量的減少，并可導(dǎo)致組織缺血缺氧的發(fā)生. 水楊酸鈉是否影響下丘

9、核腦組織血流量，是否可導(dǎo)致組織缺血缺氧的發(fā)生以及是否影響攜氧球蛋白NGB的含量、表達(dá)等,對(duì)明確水楊酸鈉給藥引起耳鳴、聽力下降［5］等毒副作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)有著十分重要的意義. 我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究水楊酸鈉給藥</p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p&

10、gt;　　TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒（MBI公司）;Taq DNA聚合酶(生工公司); DL2000Marker(大連寶生物); 48只成年健康昆明小鼠18～25 g, 雌雄不拘(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1分組與處理小鼠48只隨機(jī)分成A, B, C, D四組，每組

11、12只. A：對(duì)照組；B, C, D分別為200, 300和450 mg/(kg&#12539;d)水楊酸鈉給藥組, 各組均經(jīng)腹腔注射給藥，A組給以同體積的生理鹽水，所有動(dòng)物自由飲食. 給藥15 d后處死檢測(cè). </p><p>　　1.2.2RTPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)NGB mRNA的表達(dá) </p><p>　　1.2.2.1實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)總RNA的提取取昆明小鼠下丘核區(qū)腦

12、組織100 mg移入1.5 mL EP管中；加Trizol試劑1 mL，混勻，置室溫5 min；加氯仿0.2 mL,搖震15 s, 置室溫2～3 min；4℃，10 000 g離心5 min；仔細(xì)吸取上層水相，移至另一EP管中；加0.5 mL異丙醇, 置室溫10 min；4℃，10 000 g離心10 min；750 mL/L乙醇(DEPC水配制) 1 mL,搖震,充分洗滌沉淀，4℃ 10 000 g離心5 min；棄上清，中空干燥后

13、沉淀重懸于無(wú)Rnase水中-70℃保存?zhèn)溆? 以電泳和波長(zhǎng)260 nm光譜吸收的情況來(lái)判定所抽提RNA的質(zhì)量和濃度. </p><p>　　1.2.2.2cDNA第一鏈的合成方法將總RNA 0.1～5 μg, oligol(dT)8引物（5 μg/mL） 1 μL加無(wú)Rnase水至12 μL輕輕混勻，依次加入EP管,離心3～5 s. 將混合物置70℃ 5 min. 置冰上冷卻并離心（短暫）. 將EP管置于冰上，依

14、次加入試劑5×Buffer 4 μL, Rnase抑制劑（20 U/μL） 1 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL. 37℃孵育5 min；加入逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL） 1 μL 42℃孵育60 min；70℃加熱10 min,冰上冷卻，-70℃保存?zhèn)溆? </p><p>　　1.2.2.3擴(kuò)增引物合成和PCR反應(yīng)條件及體系擴(kuò)增引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下：N

15、GB (615 bp Genbank accession number BC024263)上游：5′CTAGTCGACGAGATGGCGCTGCAT3′下游5′CGCGGATCCACTACAACAGGCAGATCAAC3′,擴(kuò)增片段615 bp. βactin上游：5′GACGATGATATTGCCGCACT3′ 下游: 5′GATACCACGCTTGCTCTGAG3′擴(kuò)增片段186 bp (Genbank accession numb

16、er AB117093). </p><p>　　PCR反應(yīng)體系包括：ddH2O 35 μL，MgSO4 buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，P1 1 μL， P2 1 μL，Template 2 μL， Taq酶1 μL. 將其混勻，短暫離心30 s. 94℃預(yù)變性4 min，94℃ 30 s，55℃ 1 min 45 s，72℃ 2 min，循環(huán)30次，72℃延伸5 min. 取2

17、 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定. </p><p>　　1.2.3WesternBlot分析實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)NGB蛋白的表達(dá)收集實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)腦組織. 用單去污法裂解細(xì)胞. 樣品進(jìn)行SDSPAGE后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜, 加入含50 g/L去脂奶粉封閉液，室溫?fù)u床溫育2 h. 封閉液按1∶400稀釋兔多克隆抗小鼠NGB抗體，將結(jié)合蛋白的硝酸纖維素膜放入塑料袋，封口后置4℃過(guò)夜. 加入用50

18、 g/L去脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗1∶5000（山羊抗IgG），置室溫?fù)u床1 h. TBS洗硝酸纖維素膜3次，每次20 min，室溫?fù)u動(dòng). 滴加化學(xué)發(fā)光試劑，X光片感光（感光膠片為Kodak產(chǎn)品）. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P&lt;0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. </p><p>

19、;<b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1RTPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)NGB mRNA的表達(dá)結(jié)果NGB mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果見Fig 1和Tab 1. 從Tab 1可見小鼠下丘核區(qū)NGB mRNA表達(dá)對(duì)照組明顯高于三個(gè)水楊酸鈉給藥組（P&lt;0.01）；三個(gè)水楊酸鈉給藥組NGB mRNA表達(dá)比較以D組最低，B組表達(dá)最高，且明顯高于C組（P&lt;0.05

20、）和D組（P&lt;0.01），C組與D組比較有顯著性差異（P&lt;0.05）.表1水楊酸鈉給藥對(duì)小鼠下丘核NGB mRNA和蛋白表達(dá)的影響（略） </p><p>　　2.2WesternBlot分析實(shí)驗(yàn)小鼠下丘核區(qū)NGB蛋白表達(dá)WesternBlot檢測(cè)結(jié)果從圖中可看出實(shí)驗(yàn)各組均表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為17 000 NGB蛋白. A組NGB蛋白表達(dá)明顯高于其他各組；三個(gè)水楊酸鈉給藥組NGB蛋白B

21、組表達(dá)最高，且明顯高于C組和D組， D組NGB蛋白表達(dá)最低（Fig 2）. </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　研究證明［6-8］慢性水楊酸鈉給藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損傷作用，導(dǎo)致神經(jīng)元加速退行性變，認(rèn)為引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的原因可能與水楊酸鈉給藥后可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些腦區(qū)局部缺血有關(guān). </p><p>

22、　　NGB在腦缺氧的適應(yīng)性保護(hù)過(guò)程中起重要作用［9］，同時(shí)NGB可增加神經(jīng)細(xì)胞的氧供應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能. 另外， NGB的含量降低可導(dǎo)致神經(jīng)元對(duì)氧的利用率低，對(duì)缺氧的耐受性差，有可能是神經(jīng)細(xì)胞易于變性死亡的一個(gè)因素. </p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉給藥后可明顯下調(diào)下丘核腦組織NGB mRNA和蛋白的表達(dá)，并且這種影響與水楊酸鈉給藥劑量相關(guān)，即隨給藥劑量的增加下丘核腦組織NGB mRNA和蛋白的

23、表達(dá)出現(xiàn)遞減. 由于NGB在腦缺氧的適應(yīng)性保護(hù)過(guò)程中起重要作用，故此推測(cè)水楊酸鈉致中樞神經(jīng)損傷可能與NGB表達(dá)的減少有關(guān)，因?yàn)镹GB含量的降低必定會(huì)導(dǎo)致局部氧含量的下降，繼而導(dǎo)致小鼠下丘核出現(xiàn)核不規(guī)則、核周間隙變寬、核周細(xì)胞質(zhì)減少、核周細(xì)胞器呈片狀液化消失、核糖體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分融合消失、線粒體的腫脹變性和髓鞘內(nèi)結(jié)構(gòu)變性溶解等下丘核超微結(jié)構(gòu)的破壞也就不足為奇. 而線粒體等超微結(jié)構(gòu)的破壞將影響細(xì)胞氧化供能和細(xì)胞的代謝功能，使腦功能降低. 髓

24、鞘內(nèi)結(jié)構(gòu)變性將導(dǎo)致神經(jīng)元之間聯(lián)系的復(fù)雜程度降低，影響神經(jīng)元之間信息的傳導(dǎo)和處理功能. 是否NGB含量的減少與水楊酸鈉給藥后引起耳鳴和聽力下降相關(guān)則有待電生理學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)的進(jìn)一步證實(shí). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ Burmester T, Weich B, Reinhardt SA. Vertebrate gl

25、obin expressed in the brain［J］. Nature，2000;407(6803):520-523. </p><p>　?。?］ Jen PH, Sun X, Chen QC. An electrophysiological study of neural pathways for corticofugally inhibited neurons in the central nuc

26、leus of the inferior colliculus of the big brown bat, Eptesicus fuscus ［J］. Exp Brain Res, 2001; 137:292-302. </p><p>　　［3］ CandelarioJalil E, GonzalezFalcon A, GarciaCabrera M， et al. Assessment of the rela

27、tive contribution of COX1 and COX2 isoforms to ischemiainduced oxidative damage and neurodegeneration following transient global cerebral ischemia［J］. J Neurochem, 2003;86(3):545-555. </p><p>　　［4］ Weissmann

28、 G, Montesinos MC, Pillinger M, et al. Nonprostaglandin effects of aspirin III and salicylate: Inhibition of integrindependent human neutrophil aggregation and inflammation in COX 2 and NF kappa B (P105)knockout mice［J］.

29、 Adv Exp Med Biol, 2002;507:571-577. </p><p>　?。?］ Ruttiger L, Ciuffani J, Zenner HP, et al. A behavioral paradigm to judge acute sodium salicylateinduced sound experience in rats: A new approach for an anim

30、al model on tinnitus［J］. Hear Res, 2003;180(12):39-50. </p><p>　?。?］ Quan N, Mhlanga JD, Whiteside MB, et al. Chronic sodium salicylate treatment exacerbates brain neurodegeneration in rats infected with Try

31、panosoma brucei［J］. Neuroscience, 2000;96(1):181-194. </p><p>　?。?］ Najbauer J, Schuman EM, Mamelak AN. The aspirin metabolite sodium salicylate causes focal cerebral hemorrhage and cell death in rats with k

32、ainic acidinduced seizures［J］. Neuroscience, 2000;99(1):107-117. </p><p>　　［8］ Venturini L, Sparber SB. Salicylate and cocaine: interactive toxicity during chicken midembryogenesis［J］. Free Radic Biol Med, 2