1、神經(jīng)氨酸酶(NA)是禽流感病毒的兩種表面糖蛋白之一，屬Ⅱ型糖蛋白，是一種糖苷外切酶，具有酶切活性。NA具有雙重功能，一方面對于流感病毒本身而言，它可以裂解唾液酸和附近的糖殘基之間的α-糖苷鍵，有利于子代病毒釋放出來，并且在子代病毒從宿主細胞表面釋放時能防止病毒聚集，促進病毒穿過覆蓋在呼吸道上皮細胞的黏液而擴散；另一方面對于宿主細胞而言，由于宿主細胞膜上的神經(jīng)氨酸(又名唾液酸，SA.)是流感病毒的主要受體，流感病毒與宿主細胞膜上SA受體結

2、合后，才能進入細胞。而NA可以降解宿主細胞膜上的SA受體，抑制病毒進入細胞，使細胞免受AIV的感染。由于NA這一獨特功能特點對防治AIV具有重要的意義，使其成為國內(nèi)外抗禽流感病毒研究的熱點之一，同時也為制備抗禽流感轉(zhuǎn)基因家禽提供了新思路。本研究通過克隆NA基因，進行體內(nèi)外表達、亞細胞定位及抗病毒活性檢測，旨在探索將NA基因用于研制抗病轉(zhuǎn)基因家禽的新思路。主要研究內(nèi)容和結果如下：
　　 1.NA基因的克隆、序列分析及原核表達。設計

3、合成NA基因特異性引物，以質(zhì)粒pGEM-T-NA為模板，采用大引物PCR定點誘變技術將NA基因突變修正后克隆至pMD19-T Vector中，酶切與測序結果均表明pMD19-T-NA構建正確，且NA基因ORF正確無誤。然后將NA基因定向克隆入載體pGEX-6P-1中，構建原核表達載體pGEX-NA；經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE電脈分離，免疫印跡檢測表明，重組NA蛋白獲得了表達，且抗NA血清可識別表達產(chǎn)物。
　　 2.神經(jīng)

4、氨酸酶基因表達質(zhì)粒免疫小鼠的研究。將NA基因定向克隆入pcDNA3.0載體中，構建表達載體pcDNA3.0-NA，采用不同免疫方式，分別以不同劑量的表達質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠；免疫后不同時間采集血液，分離收集血清；ELISA檢測分析免疫效應。結果表明，所構建的表達質(zhì)粒pcDNA3.0-NA免疫小鼠后可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。
　　 3.體外重組神經(jīng)氨酸酶的表達及其亞細胞定位研究。構建攜帶有EGFP報告基因融合表達載體pcDNA

5、3.0/EGFP-NA，并與pcDNA3.0-NA分別用PEI介導轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞系。轉(zhuǎn)染48 h后，前者直接在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光在細胞中的位置，后者先經(jīng)間接免疫熒光檢測，然后再在顯微鏡下觀察熒光在細胞中的位置。兩種方`結果一致，熒光集中分布在胞質(zhì)近胞膜，細胞核內(nèi)無熒光。通過熒光在細胞中的分布將重組NA蛋白表達定位在細胞膜上。
　　 4.神經(jīng)氨酸酶抗病活性的研究。構建的真核表達載體pcDNA3.0-NA，用PEI