1、果實發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜生物學(xué)過程。作為非呼吸躍變型果實，柑橘果實發(fā)育和成熟過程的研究盡管已經(jīng)逐步得到重視，但是對其分子調(diào)控機制的詮釋還遠遠不夠。果實成熟過程中形成的糖、酸和類胡蘿卜素等物質(zhì)是柑橘果實品質(zhì)的重要組成部分，因此，研究柑橘果實成熟的分子以及類胡蘿卜素等的積累機制對提高果實品質(zhì)具有重要的理論價值。突變體‘紅暗柳’甜橙果實在具有紅肉性狀的同時也表現(xiàn)為高蔗糖和低檸檬酸水平，為我們研究果實品質(zhì)性狀形成的分子機理提供了理想材料。本

2、研究以突變體‘紅暗柳’與野生型‘暗柳’為材料，采用表達譜測序技術(shù)分析了兩者果實發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的差異，并重點描述了甜橙果實發(fā)育和成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化，同時對一個候選基因CsASR的功能進行分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1利用Illumina測序平臺對‘紅暗柳’與‘暗柳’各4個發(fā)育時期（120 DAF,150 DAF,190 DAF和220 DAF）果實的果肉進行數(shù)字化表達譜測序。獲得的平均標(biāo)簽數(shù)目約4.01M。將測序所得

3、所有標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫中的序列比對，發(fā)現(xiàn)占clean reads68.1％-76.2％共46，328-76，424條標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫中已知功能或未知功能的序列具有同源性。
　　 以‘暗柳’為模型研究甜橙果實發(fā)育與成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組變化。總共檢測到18，829個基因至少在一個時期表達，其中8，825個基因在所有四個時期都有表達。利用Cluster軟件對‘暗柳’甜橙果實發(fā)育和成熟過程中基因的表達模式進行聚類分析，所有的18，829個基

4、因被聚成22類。聚類分析的結(jié)果也顯示在‘暗柳’甜橙里檢測到89.7％的基因表達量在果實發(fā)育和成熟的過程中發(fā)生了變化。比較突變體與野生型的基因表達模式發(fā)現(xiàn)兩個品種中有20類表達模式是共同的。
　　 比較‘暗柳’甜橙不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組分別發(fā)現(xiàn)9，377個基因在花后120 d和150 d差異表達;7，886個基因在花后150 d和190 d差異表達;7，757個基因在花后190 d和220 d差異表達。生物學(xué)過程的GO注釋分類結(jié)果顯示

5、，這些基因中36.7％被注釋18條GO類型，且絕大部分基因被注釋到代謝過程、細胞過程、建立定位、生物學(xué)調(diào)節(jié)、著色和逆境響應(yīng)等。這些差異表達基因主要參與細胞壁代謝和軟化、蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)、類胡蘿卜素代謝和逆境響應(yīng)。
　　 比較不同發(fā)育時期‘暗柳’‘紅暗柳’果實的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示分別有634、568、540和616個基因的表達在突變體和野生型花后120 d、150d、190 d和220 d有顯著差異(p＜0.05和|log2Ra

6、tio[≥1)。許多差異表達基因編碼逆境相關(guān)蛋白。對差異表達基因的數(shù)目進行分析發(fā)現(xiàn)在所有研究的這四個時期，突變體上調(diào)表達基因數(shù)目都少于該時期下調(diào)表達基因數(shù)目。去除冗余，在‘暗柳’和‘紅暗柳’中差異表達的基因數(shù)目僅883個。對這些差異表達基因進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)除花后150 d外，與野生型相比超過一半的基因(492)在突變體所有的發(fā)育時期均上調(diào)表達。僅5個基因被發(fā)現(xiàn)在所有四個時期均差異表達?；诜肿庸δ艿腉O注釋分類分析顯示883個差異表達

7、基因大多數(shù)被注釋到蛋白結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性和轉(zhuǎn)運子活性。GO富集分析顯示類胡蘿卜素代謝過程和辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶活性在突變體花后150 d的果實顯著富集。
　　 利用Real-Time PCR的方法對選擇的22個差異表達基因在突變體和野生型果實發(fā)育和成熟過程中的表達進行驗證，獲得的基因表達模式與高通量測序所得的結(jié)果基本一致，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.8379。
　　 我們也測定了‘暗柳’和‘紅暗柳’果實發(fā)育和成熟

8、過程中果肉可溶性糖、有機酸、類胡蘿卜素和H2O2的含量變化。在果實發(fā)育和成熟的后期可溶性糖的含量在‘暗柳’和‘紅暗柳’中均顯著增加。在整個果實發(fā)育和成熟過程中，‘紅暗柳’果肉中的蔗糖含量均顯著高于‘暗柳’，但是檸檬酸含量均顯著低于‘暗柳’?？傤惡}卜素和番茄紅素在‘紅暗柳’中大量積累，但是在‘暗柳’中均維持比較低的含量。隨著果實的發(fā)育和成熟，H2O2的含量下降，但是在花后120 d，‘紅暗柳’果肉中H2O2含量顯著高于‘暗柳’。

9、　　 2轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果以及前人的報道都顯示ASR基因在‘紅暗柳’和‘暗柳’中表達差異顯著。根據(jù)獲得的基因片段(FE659120)利用Tail-PCR擴增獲得甜橙ASR基因的cDNA全長，命名為CsASR，GenBank登錄號為HQ398364。進一步在甜橙中擴增獲得DNA全長1213 bp，含一個內(nèi)含子。CsASR的cDNA全長為929 bp，開放讀碼框為540 bp，編碼179個氨基酸。同源性分析表明甜橙CsASR推導(dǎo)的氨基酸序列

10、與其他物種克隆的ASR基因有較高的同源性。保守區(qū)域分析表明CsASR與其他已知的ASR蛋白一樣，它們的氨基酸序列都包含兩個高度保守的區(qū)域。功能預(yù)測推測其可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，生長發(fā)育，轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，概率分別為0.241，0.110，0.072和0.063。
　　 Southern雜交分析顯示在大多數(shù)柑橘品種中，CsASR屬于一個小的多基因家族。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)CsASR與其他大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子一樣定位在細胞核中。對CsASR基因在‘

11、暗柳’和‘紅暗柳’不同發(fā)育時期果實以及不同組織中的表達進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsASR基因主要在成熟組織，特別在成熟果實中表達。CsASR基因在‘暗柳’的果肉和果皮中的表達模式相同，但是在‘紅暗柳’的果肉和果皮中CsASR的表達模式不同，除了在花后120 d，整個發(fā)育時期CsASR基因在‘紅暗柳’中的表達都比在‘暗柳’中的高。對CsASR基因在不同逆境條件下甜橙愈傷中的表達進行分析，結(jié)果顯示高鹽、低溫、熱和ABA處理條件下，CsASR基因均

12、被顯著誘導(dǎo)表達。
　　 用外源ABA處理‘暗柳’和‘紅暗柳’轉(zhuǎn)色前果實，結(jié)果顯示ABA誘導(dǎo)‘紅暗柳’果肉中可溶性糖和有機酸含量增加，而在‘暗柳’中，ABA處理導(dǎo)致可溶性糖和有機酸含量降低。但是對于類胡蘿卜素我們只檢測到花藥黃質(zhì)和α-胡蘿卜素，盡管ABA處理后‘暗柳’果肉中類胡蘿卜素的含量降低，但是在‘紅暗柳’果肉中ABA處理前后類胡蘿卜素的含量沒有顯著的變化。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化在番茄中超量表達CsASR基因，

13、共獲得11株抗性植株，T1代分離的陽性植株成熟果實顯示與對照不同的紅色。這些抗性植株與對照相比在形態(tài)學(xué)及果實的成熟期上并沒有明顯的差異。微分干涉顯微觀察的結(jié)果顯示超量表達CsASR的番茄成熟果實的果皮細胞呈現(xiàn)紅色，而對照為黃色。冷凍切片在明場下也顯示兩者的細胞結(jié)構(gòu)有所不同，轉(zhuǎn)基因番茄果實的細胞壁與對照相比增厚;進一步在熒光下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實的細胞壁呈現(xiàn)很強的藍色熒光，即木質(zhì)素含量較高，而對照表現(xiàn)不明顯。
　　 HPLC分析

14、結(jié)果顯示紫黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、番茄紅素和八氫番茄紅素的含量在CsASR超量表達番茄植株的成熟果實中都顯著增加，而葉黃素的含量沒有明顯的差異。與對照相比，所有檢測的類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因在CsASR超量表達番茄植株的成熟果實中都上調(diào)表達。
　　 GC-MS分析結(jié)果顯示很多主要代謝產(chǎn)物的含量在轉(zhuǎn)基因番茄果實中均發(fā)生了改變。幾乎所有檢測到的糖類代謝物及包括三羧酸循環(huán)代謝中間產(chǎn)物在內(nèi)的所有檢測到的有機酸的含量在CsASR超量表達的番茄果

15、實中都低于對照。很多氨基酸的含量也發(fā)生了變化。對CsASR超量表達的番茄果實中主要代謝相關(guān)基因的表達分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要代謝產(chǎn)物的變化與相應(yīng)基因表達是吻合的。LC-MS技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因番茄果實中ABA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsASR超量表達的番茄果實中ABA的含量顯著低于對照。
　　 表達譜測序結(jié)果顯示，與對照相比總共有401個基因在CsASR超量表達番茄果實中顯著差異表達(FDR≤0.001 and|log2Ratio|≥1)，其中18