1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　高性能淀粉酶菌株的篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 </p&g

2、t;<p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要:淀粉酶是重要的工業(yè)用酶之一，高活性淀粉酶的生產(chǎn)是產(chǎn)業(yè)界的熱點(diǎn)。利用選擇性培養(yǎng)方式獲

3、得淀粉酶高產(chǎn)菌株，并通過對其發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究，比較其生產(chǎn)性能。從不同來源的曲中分離篩選到一株較高活性的淀粉酶生產(chǎn)菌株，根據(jù)該菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為黑曲霉。該菌株命名為CH1，在培養(yǎng)基優(yōu)化后，淀粉酶活性達(dá)到101.686u/mL。其最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為6.0。該酶在70℃及以下溫度內(nèi)處理30min，酶活損失不大，具有一定的耐熱性，該酶在pH值為5.0～7.0范圍內(nèi)處理30min，仍保持高酶活，具有一定的

4、耐酸性。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 淀粉酶；分離篩選；發(fā)酵條件；酶學(xué)性質(zhì)</p><p>　　Screening of Strains for the production of high-performance amylase </p><p>　　Abstract: This study aims to obtain amylase production

5、strains with high activity and wider ranges of temperatures and pH value. The strain CH1 producing amylase was isolated from daqu, which come from different resource. The strain had high ability to produce amylase．Accor

6、ding to analysis of the culture characteristics and morphology, the strain could be identified as Aspergillus niger CH1．In optimized condition, amylase activity reached 101.686 u/mL. The optimal reaction temperature 60 ℃

7、, the</p><p>　　Keywords: amylase; separation and screening; fermentation; enzymology property .</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要:I</b></p><p&

8、gt;　　Abstract:II</p><p><b>　　1 緒論3</b></p><p>　　1.1 淀粉酶簡介3</p><p>　　1.2 淀粉酶來源3</p><p>　　1.3 淀粉酶的應(yīng)用4</p><p>　　1.4 淀粉酶的研究進(jìn)展5</p>

9、;<p>　　1.5 論文目標(biāo)7</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)部分8</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)流程8</p><p>　　2.2 分析方法8</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)材料8</p><p>　　2.3.1 樣品來源8</p

10、><p>　　2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑8</p><p>　　2.3.3 培養(yǎng)基配方9</p><p>　　2.3.4 主要試劑配制9</p><p>　　2.3.5 主要儀器9</p><p>　　2.4 實(shí)驗(yàn)方法9</p><p>　　2.4.1 培養(yǎng)基的制備9</p&

11、gt;<p>　　2.4.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選10</p><p>　　2.4.3 菌種的保藏11</p><p>　　2.4.3 菌種形態(tài)的初步觀察及初步鑒定11</p><p>　　2.4.4 菌種發(fā)酵11</p><p>　　2.4.5 淀粉酶活力測定12</p><p>　　2

12、.4.6 發(fā)酵過程中不同時(shí)間產(chǎn)酶量的測定13</p><p>　　2.4.7 不同碳源、氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響13</p><p>　　2.4.8 培養(yǎng)基優(yōu)化13</p><p>　　2.4.9 淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究17</p><p>　　3.1 淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定18</p><p>　　3.2

13、 菌種篩選結(jié)果19</p><p>　　3.3 菌種顯微觀察結(jié)果19</p><p>　　3.4 發(fā)酵過程不同時(shí)間產(chǎn)酶量的測定結(jié)果20</p><p>　　3.5培養(yǎng)基優(yōu)化21</p><p>　　3.5.1 碳源對產(chǎn)淀粉酶活力的影響21</p><p>　　3.5.2 氮源對產(chǎn)淀粉酶活力的影響21<

14、/p><p>　　3.5.3 正交法優(yōu)化培養(yǎng)基22</p><p>　　3.6酶學(xué)性質(zhì)研究24</p><p>　　3.6.1 溫度對淀粉酶的影響24</p><p>　　3.6.2 pH對淀粉酶的影響25</p><p><b>　　4 結(jié)論27</b></p><p

15、><b>　　參考文獻(xiàn)28</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 淀粉酶簡介</p><p>　　淀粉酶是催化淀粉、糖原轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，廣泛應(yīng)用于淀粉工業(yè)、食品工

16、業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒等行業(yè)[1]。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)的酶，迄今為止仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一[2]。</p><p>　　不同種類的淀粉酶水解淀粉會(huì)生成不同的產(chǎn)物。常見的淀粉酶可以分為以下幾種：α-淀粉酶（EC3.2.l.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），也叫γ -淀粉酶，簡稱糖化酶（縮寫GA或G）；異淀粉酶

17、（EC3.2.1.68）等[3]。α-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為α構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘度下降；β-淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，其產(chǎn)物還原性末端葡萄糖單位碳原子為β構(gòu)型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解α-l，4糖苷鍵和分支的α-1，6-糖苷鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6糖苷鍵，切下側(cè)枝鏈

18、[5]。</p><p>　　對淀粉酶的分類和作用機(jī)制研究較多，可按來源、產(chǎn)物的旋光度、作用機(jī)制等進(jìn)行分類。但近年隨著酶學(xué)性質(zhì)的研究的發(fā)展，對酶的作用機(jī)制、方式等研究不斷取得新成果，分類學(xué)問題出現(xiàn)許多難點(diǎn)。我國在食品方面研究和應(yīng)用的微生物酶估計(jì)有30多種[6]，其中淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶、環(huán)糊精生成酶等。</p><p>　　1.2 淀粉酶來源&

19、lt;/p><p>　　淀粉酶的來源很廣泛，可以來自于植物、動(dòng)物以及微生物。大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的兩種淀粉酶為α-淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于植物中的β-淀粉酶也存在于少量微生物中。</p><p>　　α-淀粉酶可以從幾種細(xì)菌、真菌和酵母中分離獲得。但是，由于細(xì)菌淀粉酶具有幾個(gè)比較優(yōu)良的特性，因此，細(xì)菌淀粉酶用的比較多，特別是淀粉液化芽孢桿菌已用于工業(yè)化生產(chǎn)[5

20、]。不像其他的淀粉酶，微生物僅產(chǎn)生少量的β-淀粉酶，有桿菌（假單孢桿菌和梭狀芽孢桿菌）等。</p><p>　　葡糖淀粉酶具有多種來源，植物、動(dòng)物及微生物，但是，商業(yè)上所用的葡糖淀粉酶也是來源于微生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要來源。</p><p>　　1.3 淀粉酶的應(yīng)用</p><p>　　1.3.1 面包焙烤工業(yè) </p>&l

21、t;p>　　作為保鮮劑酶應(yīng)用在焙烤工業(yè)中生產(chǎn)各種高品質(zhì)的產(chǎn)品已經(jīng)有幾百年的歷史。最近幾十年，麥芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被廣泛用于焙烤工業(yè)。這些酶用于面包工業(yè)，使這些產(chǎn)品體積更大，顏色更好，顆粒更柔軟。焙烤工業(yè)中的α-淀粉酶一直是從大麥麥芽和細(xì)菌、真菌中提取的?，F(xiàn)代化連續(xù)焙烤過程中，在面粉中添加α-淀粉酶不僅可以增加發(fā)酵率、降低生面團(tuán)黏度，增加生面團(tuán)中糖的含量，改良面包的口感、外皮顏色和焙烤質(zhì)量，還可以延長焙烤食品的保鮮時(shí)間[

22、7-9]。 </p><p>　　最近，人們開始關(guān)注酶作為防腐劑、保鮮劑在生面團(tuán)改良方面的作用，如支鏈淀粉酶和α-淀粉酶配合可以有效的用于防腐。然而過量的α-淀粉酶會(huì)導(dǎo)致面包過粘。因此，最近的趨勢是使用中溫穩(wěn)定(ITS)α-淀粉酶，它們在淀粉液化后活性很高，但在焙烤過程完成前就失活。盡管已發(fā)現(xiàn)大量的微生物可以生產(chǎn)α-淀粉酶，但是具有中溫穩(wěn)定性質(zhì)的α-淀粉酶僅在幾種微生物中被發(fā)現(xiàn)。 </p><

23、p>　　1.3.2 淀粉的液化作用和糖化作用 </p><p>　　α-淀粉酶的主要市場是淀粉水解的產(chǎn)物，如葡萄糖和果糖。淀粉被轉(zhuǎn)化為高果糖玉米糖漿。由于它們的高甜度，被用于飲料工業(yè)中軟飲料的甜味劑。這個(gè)液化過程就用到在高溫下熱穩(wěn)定性好的α-淀粉酶。α-淀粉酶在淀粉液化上的應(yīng)用工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，已有很多相關(guān)報(bào)道。 </p><p>　　1.3.3 纖維脫漿 </p>

24、<p>　　現(xiàn)代纖維制造工藝在編織過程中會(huì)在紗線中產(chǎn)生大量的細(xì)菌，為防止這些紗線斷裂，往往會(huì)在紗線的表面加一層可去除的保護(hù)層。這些表面層的材料有很多種，淀粉是非常好的一個(gè)選擇。因?yàn)樗阋?、容易獲取，并且可以很容易去除。淀粉脫漿可以利用α-淀粉酶，它能有選擇性地去除淀粉漿而不傷害紗線纖維，還能隨機(jī)地使淀粉降解為易溶于水的糊精，因而容易被洗掉[7-9]。 </p><p>　　1.3.4 造紙工業(yè) &l

25、t;/p><p>　　淀粉酶在造紙工業(yè)中的用途主要是改良紙張涂層淀粉。紙張上的漿糊主要是保護(hù)紙張?jiān)谔幚磉^程中免于機(jī)械損傷，它同樣也改良了成品紙的質(zhì)量。漿糊提高了紙張的硬度和強(qiáng)度，增強(qiáng)了紙張的可擦除性，是一種很好的紙張涂料。當(dāng)紙張穿過2個(gè)軋輥時(shí)，淀粉漿被加入紙張。這個(gè)過程的溫度控制在45～60 ℃,需要淀粉有穩(wěn)定的黏度。研磨同樣可以根據(jù)不同紙張等級控制淀粉的黏度。自然界的淀粉濃度對于紙張上漿來說太高，可以利用α-淀粉酶

26、部分降解淀粉來調(diào)節(jié)。 </p><p>　　1.3.5 除垢劑中的應(yīng)用 </p><p>　　酶是現(xiàn)代高效除垢劑的成分之一。酶在除垢劑中最大的功能就是使除垢劑更溫和無害。早期自動(dòng)洗碗機(jī)的除垢劑非常粗糙，易在進(jìn)食時(shí)對人體造成傷害，而且對陶瓷、木質(zhì)餐具也會(huì)造成損害。α-淀粉酶從1975年就被應(yīng)用于制造洗衣粉?，F(xiàn)在，90%液體除垢劑都含有α-淀粉酶，而且自動(dòng)洗碗機(jī)的除垢劑對α-淀粉酶的需求也在

27、不斷增長。α-淀粉酶對Ca2+過于敏感，在低Ca2+的環(huán)境下穩(wěn)定性很差，這限制了α-淀粉酶在除垢劑中的應(yīng)用[7-9]。</p><p>　　1.3.6 制藥和臨床化學(xué)分析 </p><p>　　隨著生物工程的不斷發(fā)展,淀粉酶的應(yīng)用涉及到許多其他領(lǐng)域,比如臨床、制藥和分析化學(xué)。已有報(bào)道，基于α-淀粉酶的液體穩(wěn)定試劑已應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀(Ciba Coming Express)臨床化學(xué)系

28、統(tǒng)，已經(jīng)建立起一種利用淀粉酶探測更高低聚糖含量的方法。據(jù)稱，這種方法比硝酸銀探測方法更為有效。 </p><p>　　1.4 淀粉酶的研究進(jìn)展</p><p>　　淀粉酶中，尤以α-淀粉酶最為常用，隨著社會(huì)需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對α-淀粉酶的需求量越來越大。 </p><p>　　1.4.1 α-淀粉酶的催化機(jī)理</p><p>　　目前

29、公認(rèn)的α-淀粉酶的催化機(jī)理[9。10]，催化中心位于α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的兩個(gè)重要?dú)埢Ｕ麄€(gè)催化過程可分三步：第一步，淀粉鏈中的糖苷氧被質(zhì)子供體261谷氨酸質(zhì)子化；第二步，親核基團(tuán)231位天冬氨酸親核攻擊葡萄糖殘基的C1，糖苷鍵斷裂，葡萄糖殘基與231位天冬氨酸形成酯鍵，同時(shí)去質(zhì)子化狀態(tài)的261位谷氨酸奪取一個(gè)水分子H+，產(chǎn)生一個(gè)OH-；第三步，OH- 攻擊葡萄糖殘基的C1，使酯鍵斷裂，26

30、1位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢復(fù)初始狀態(tài)。在已知結(jié)構(gòu)的α-淀粉酶中，在α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸兩個(gè)殘基，它們的相對位置相似，并且所有α-淀粉酶的整體三維結(jié)構(gòu)都很相似，因此，它們的催化反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該是相同或相近的[10]。以對α-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究為基礎(chǔ)，通過各種手段改善酶的催化反應(yīng)特異性，使其更適合于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用是近年來新興的發(fā)展趨勢。</p><p>　　1.4.2 α-

31、淀粉酶的突變研究</p><p>　　目前應(yīng)用得最廣泛的基因水平上的突變主要有兩種，即隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變，有時(shí)也將兩種方法結(jié)合使用。隨機(jī)突變首先需構(gòu)建突變文庫，然后根據(jù)研究酶的特點(diǎn)設(shè)計(jì)高通量的篩選方法。它的優(yōu)點(diǎn)是不必明確知道酶的三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等。定點(diǎn)突變需要對酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理有較明確的認(rèn)識，它更適用于研究單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)對酶分子的影響。將這些方法應(yīng)用于α-淀粉酶的研究已有一定進(jìn)展。目前有關(guān)突變的研究大多針對于地衣芽

32、胞桿菌活菌，如 Takase研究發(fā)現(xiàn)天冬酰胺326賴氨酸/天冬氨酸能夠顯著改變地衣芽胞桿菌活菌pH特性[11]。Nielsen J E等對地衣芽胞桿菌活菌進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺264絲氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞桿菌活菌的熱穩(wěn)定性。Shaw A 等[12]通過隨機(jī)突變，得到Met15Thr，能增強(qiáng)地衣芽胞桿菌活菌的穩(wěn)定性，在此突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變，發(fā)現(xiàn)Met15Thr和天冬酰胺188絲氨酸使地衣芽胞桿菌活菌熱穩(wěn)定性

33、提高2倍[12]。但目前就氨基酸突變?nèi)绾螌?dǎo)致酶宏觀性質(zhì)的改變有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　1.4.3 基因克隆及氨基酸序列</p><p>　　分子生物技術(shù)的發(fā)展，對α-淀粉酶的研究已進(jìn)入分子水平階段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因編碼及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性狀表達(dá)等方面都取得較大的進(jìn)展，基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了淀粉酶生產(chǎn)菌株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶

34、基因克隆方面已經(jīng)作了大量的工作，主要在大腸桿菌等。Suganuma等研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。Kim等描述了編碼一種新α-淀粉酶的基因，該基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)[13]。</p><p>　　Steyn和Pretorius 編碼α-淀粉酶基因(AMY)編碼GA的基因(STA 2)轉(zhuǎn)入一個(gè)酵母菌的整合載體(Yip5)，形成重組質(zhì)粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同連接到載體Yip5中，產(chǎn)生

35、質(zhì)粒pSP3。隨后，編碼抗Geneticin 418 顯性標(biāo)記的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。為了增強(qiáng)Geneticin 418的表達(dá)，pSP4再連接啟動(dòng)子GAL10和終止子URA3，這樣就得到質(zhì)粒pSP5。pSP5通過增加ARS1H和CEN4序列被修改成環(huán)形微染色體pSP6。轉(zhuǎn)入了pSP1-pSP6 的實(shí)驗(yàn)室郎酒酵母菌株能穩(wěn)定產(chǎn)多種α-淀粉酶和GA [14]。</p><p>　　1.4.4

36、 國內(nèi)α-淀粉酶類的生產(chǎn)和應(yīng)用概況 </p><p>　　1965年，我國開始應(yīng)用淀粉芽孢桿菌BF-7658生產(chǎn)α-淀粉酶，當(dāng)時(shí)只有無錫酶制劑廠獨(dú)家生產(chǎn)。1967年杭州怡糖廠實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用α-淀粉酶生產(chǎn)飴糖的新工藝，可以節(jié)約麥芽7%～10%，提高出糖率10%左右。1964年我國開始了酶法水解淀粉生產(chǎn)葡萄糖工藝的研究。l979年9月通過了酶法注射葡萄糖新工藝的鑒定，并先后在華北制藥廠、河北東風(fēng)制藥廠、鄭州嵩山制藥廠等單

37、位得到應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。與傳統(tǒng)的酸法相比，可以提高收率10%，降低成本15%以上[15]。 </p><p>　　1.4.5 國外α-淀粉酶研究現(xiàn)狀 </p><p>　　目前，除開展大量常規(guī)誘變育種T作外,國外已初步搞清產(chǎn)α-淀粉酶的調(diào)控基因，探討了有關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化和基因克隆等育種技術(shù)。將枯草芽孢桿菌重組體的基因引入生產(chǎn)菌株，使α-淀粉酶產(chǎn)量提高7～10倍，并已應(yīng)用于食品和制酒工

38、業(yè),給選育高產(chǎn)α-淀粉酶菌株開創(chuàng)了新的途徑。 </p><p>　　1.4.6 國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)及其主要研究方向 </p><p>　　由于α-淀粉酶是具有重要應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)酶，國內(nèi)外很多研究機(jī)構(gòu)對它進(jìn)行了研究。例如:四川大學(xué)，主要研究α-淀粉酶的生產(chǎn)菌株及其培養(yǎng)條件；江南大學(xué)主要研究α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以及應(yīng)用性能，如耐熱性、耐酸性;西北大學(xué)，主要研究α-淀粉酶的變性機(jī)理以及環(huán)境對α-淀粉酶

39、的影響;華南理工大學(xué)，主要研究α-淀粉酶的固定化和動(dòng)力性質(zhì);還有華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所、天津科技大學(xué)、南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國科學(xué)院微生物研究所等多家研究機(jī)構(gòu)對多種α-淀粉酶生產(chǎn)菌的α-淀粉酶基因進(jìn)行了克隆以及表達(dá)研究。國外有代表性的研究單位有：加拿大的University of British Columbia，他們對人胰腺的α-淀粉酶結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理進(jìn)行了深入的研究；丹麥的Carlsberg實(shí)驗(yàn)室

40、主要研究大麥α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域與結(jié)合位點(diǎn)；美國的Western Regional Research Center主要研究大麥的α-淀粉酶與抗菌素的作用以及大麥α-淀粉酶的活性位點(diǎn)等。 </p><p><b>　　1.5 論文目標(biāo)</b></p><p>　　(1) 篩選出產(chǎn)淀粉酶菌株數(shù)十株；　　</p><p>　　(2) 篩選出淀粉酶高產(chǎn)菌

41、株一到兩株；</p><p>　　(3) 菌種的初步分類鑒定；</p><p>　　(4) 確定發(fā)酵過程中酶的收集時(shí)間；</p><p>　　(5) 培養(yǎng)基優(yōu)化，促進(jìn)產(chǎn)酶；</p><p>　　(6) 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)部分</b></p>

42、<p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)流程 </p><p>　?。?）從不同來源的曲中篩選出產(chǎn)淀粉酶的菌株；</p><p>　　（2）用PDA培養(yǎng)基純化菌株，在用淀粉選擇性培養(yǎng)基初篩菌株；</p><p>　　（3）用液體發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩出高酶活菌株；</p><p>　?。?）菌株鏡檢與保存；</p><p>　?。?/p>

43、5）產(chǎn)淀粉酶菌株發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間； </p><p>　?。?）不同碳源、氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；</p><p>　?。?）正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基；</p><p>　　（8）酶學(xué)性質(zhì)測定。</p><p><b>　　2.2 分析方法</b></p><p>　　現(xiàn)在國內(nèi)淀粉酶的測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB8

44、275—87規(guī)定的方法，利用比色法判斷反應(yīng)終點(diǎn)，其酶活力單位定義為：一定反應(yīng)條件下，lh液化可溶性淀粉1g的酶量為1個(gè)活力單位(U)；也有科研機(jī)構(gòu)參照二硝基水楊酸法，通過測定產(chǎn)生還原糖的量來計(jì)算酶活性，其酶活力單位定義為：一定反應(yīng)條件下，每分鐘從可溶性淀粉中釋放出lumol還原糖所需的酶量為1個(gè)活力單位(U)；另外淀粉酶的活力測定還有輕工部QB547—80、QB1803—93等方法。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的CH1菌株初期淀粉酶活較低，用國家標(biāo)準(zhǔn)

45、GB8275—87規(guī)定的方法測出的酶活性較小，且反應(yīng)時(shí)間長，不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，故參照了其他文獻(xiàn)略加改進(jìn)采用2.4.5的淀粉酶活力的測定方法[16]。</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)材料 </p><p>　　2.3.1 樣品來源</p><p>　　不同的釀造用曲、空氣等自然來源。</p><p>　　2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p&

46、gt;<p>　　表1 主要的化學(xué)試劑</p><p>　　2.3.3 培養(yǎng)基配方</p><p>　　富集固體培養(yǎng)基(g)：全麥粉20，蒸餾水5。</p><p>　　初篩固體培養(yǎng)基(Ⅰ)(g/L)：可溶性淀粉 10，蛋白胨 5，NaCl 5，瓊脂 20，pH 7.0。</p><p>　　初篩固體培養(yǎng)基(Ⅱ)(g/L)

47、：馬鈴薯 200，蔗糖 20，瓊脂 20，pH 6.0.</p><p>　　復(fù)篩液體培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 10，蛋白胨1，(NH4)2SO4 4，NaCl 5，pH 7.0。</p><p>　　發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 20，蛋白胨 10，KH2PO4 1，MgSO4 0.5，NaCl 5，pH 6.0。</p><p>　　2.3.4 主

48、要試劑配制</p><p>　　（1）KI-I2溶液：稱取KI 2.0g，用5mL去離子水溶解KI，迅速稱量I2 0.5g并加入KI溶液中，攪拌溶解后用去蒸餾水定容到100mL，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中保存。</p><p>　?。?）磷酸緩沖液（pH=6.0）：稱取45.23g 磷酸二氫鈉 （NaH2PO4 ·12H2O）和8.07g檸檬酸（C6H8O7·H2O），用水溶解并定

49、容至1000mL。</p><p>　　2.3.5 主要儀器</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用儀器設(shè)備見表2。</p><p><b>　　2.4 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.4.1 培養(yǎng)基的制備</p><p>　　2.4.1.1 初篩固體培養(yǎng)基(Ⅰ)的配制：</p>

50、;<p>　　稱取可溶性淀粉2g，蛋白胨1g，瓊脂4g，加蒸餾水200mL，用電爐加熱，攪拌至瓊脂全部溶解，用蒸餾水定容至200mL，pH自然，裝于250mL的三角瓶中，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌25min，滅菌后冷卻至50℃左右，倒入已滅過菌的培養(yǎng)皿中（d=9cm），每個(gè)培養(yǎng)皿約倒入10mL培養(yǎng)基冷卻后接種。</p><p>　　表 2 主要的儀器型號</p><p>　　

51、2.4.1.2 初篩固體培養(yǎng)基(Ⅱ)配制：</p><p>　　馬鈴薯去皮切成小塊，稱取200g，煮沸0.5h，然后用紗布過濾，濾液中加入稱取好的蔗糖 20g，瓊脂 20g，加熱煮沸至瓊脂完全溶解，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)到pH 6.0，分裝后高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min，滅菌后冷卻至50℃左右，倒入已滅過菌的培養(yǎng)皿中（d=9cm），每個(gè)培養(yǎng)皿約倒入10mL培養(yǎng)基冷卻后接種。</p>

52、<p>　　2.4.1.3 復(fù)篩液體培養(yǎng)基配制：</p><p>　　稱取可溶性淀粉 10g，蛋白胨1g，(NH4)2SO4 4g，NaCl 5g，加入1000mL蒸餾水煮沸，pH調(diào)為7.0，分裝于干凈的250mL錐形瓶中，每瓶50mL培養(yǎng)基，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌25min冷卻后接種。</p><p>　　2.4.1.3 發(fā)酵液體培養(yǎng)基配制：</p><

53、;p>　　方法同復(fù)篩液體培養(yǎng)基配制。</p><p>　　2.4.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選</p><p>　　2.4.2.1 菌種富集</p><p>　　取曲少許，用研缽研成細(xì)粉，加入全麥粉混勻，用蒸餾水制成濕顆粒28℃培養(yǎng)。</p><p>　　2.4.2.2 初篩</p><p>　　先倒好初篩固體培養(yǎng)

54、基(Ⅱ)，采用平板劃線分離法分離富集起來的菌株，28℃倒置培養(yǎng)72h，配合鏡檢，多次劃線分離直至得到純的單菌落，將分離得到的菌株編號</p><p>　　將上述篩選得到的菌株進(jìn)行初篩，即用初篩固體培養(yǎng)基(Ⅰ)，仍然采用平板劃線法接種，選擇生長較好的菌株作為初篩結(jié)果。</p><p>　　2.4.2.3 復(fù)篩：</p><p>　　將初篩得到的菌株接種于復(fù)篩液體培養(yǎng)

55、基中，28℃、150r/min搖瓶發(fā)酵60h。將發(fā)酵液離心，取上清液，采用碘消法測淀粉酶活性，篩選出酶活較高的菌1～2株作為復(fù)篩結(jié)果。 </p><p>　　2.4.3 菌種的保藏</p><p>　　將CH1劃線分離培養(yǎng)，待培養(yǎng)基上長出淡黃色菌絲，取出密封低溫保藏于冰箱，另接種于試管斜面培養(yǎng)至長出孢子，于冰箱冷藏。</p><p>　　2.4.3 菌種形態(tài)的初

56、步觀察及初步鑒定</p><p>　　選擇CH1在PDA培養(yǎng)基中長出的單菌落，進(jìn)行顯微鏡觀察。</p><p><b>　　制片</b></p><p>　　拿出干凈的載玻片，于中央加入半滴無菌水，用灼燒法滅菌的接種針挑取稍帶培養(yǎng)基的少量菌絲，放于于載玻片的無菌水中。</p><p><b>　　染色</

57、b></p><p>　　在上述菌絲周圍加入一滴棉蘭染液，染色幾分鐘，用鑷子夾上蓋玻片，覆蓋菌區(qū)，并用接種針輕壓蓋玻片，趕走氣泡。用吸水紙吸取多余的染液。</p><p><b>　　顯微鏡觀察</b></p><p>　　先于十倍鏡下觀察制片菌形態(tài)，在換四十倍鏡下觀察菌具體形態(tài)結(jié)構(gòu)。并選擇最佳視野，制圖，分析，初步進(jìn)行菌種分類。<

58、/p><p>　　2.4.4 菌種發(fā)酵 </p><p>　　(1) 預(yù)先準(zhǔn)備好PDA培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下，用接種環(huán)劃線接種，于28℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，待其表面長出大量孢子粉。</p><p>　　(2) 用接種環(huán)挑取五環(huán)孢子粉于50mL的無菌水中混勻，于恒溫振蕩器中震蕩10min，制成CH1 菌株孢子渾濁液。</p><p>　　

59、(3) 用移液槍吸取5mL菌株孢子渾濁液接種于50mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床內(nèi)以150r/min，培養(yǎng)60h。</p><p>　　2.4.5 淀粉酶活力測定</p><p>　　酶活力單位的定義：在pH6.0 、溫度60℃，5min 水解可溶性淀粉 1mg 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。</p><p>　　可溶性淀粉梯度的配制：以pH6.0

60、 、0.1% 可溶性淀粉為母液，按照表3稀釋成各個(gè)濃度梯度。</p><p>　　淀粉濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在上述各個(gè)濃度梯度的可溶性淀粉10mL加入2.5mL 0.5% KI-I2 溶液顯色，于紫外分光光度計(jì)的620nm波長測吸光度，以淀粉濃度為很坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。</p><p>　　表 3 可溶性淀粉濃度梯度配制</p><p>

61、<b>　　酶活的測定方法：</b></p><p>　　(1) 25mL比色管中依次加入1mL 的0.1%可溶性淀粉溶液（淀粉濃度可以增加），2.5mL的pH 6.0 的磷酸二氫鈉檸檬酸緩沖液，于60℃預(yù)熱10min。</p><p>　　(2) 加入0.5mL的發(fā)酵液，60℃ 保溫5min后，加入 1mL 0.1 mol/mL 的鹽酸終止反應(yīng)。</p

62、><p>　　(3) 加入1.25mL的0.5% KI-I2溶液顯色，于620nm波長下測吸光度。</p><p>　　(4) 吸光度帶入淀粉濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到反應(yīng)液淀粉濃度后計(jì)算酶活。</p><p>　　酶活力的計(jì)算公式： （0.1% - Cx）×1000</p><p>　　其中： 0.1%為底物可溶性淀粉的濃度

63、</p><p>　　Cx為反應(yīng)液淀粉的濃度</p><p><b>　　1000為換算系數(shù)</b></p><p>　　2.4.6 發(fā)酵過程中不同時(shí)間產(chǎn)酶量的測定</p><p>　　接種一環(huán)CH1于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃恒溫振蕩器內(nèi)以150r/min培養(yǎng)24h后，每隔3h ，在潔凈工作臺(tái)內(nèi)收集少量發(fā)酵液于離心管

64、中，5000r/min離心10min，取上清液測其淀粉酶活力，發(fā)酵結(jié)束后繪制發(fā)酵不同時(shí)間的相對酶活曲線。</p><p>　　2.4.7 不同碳源、氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響</p><p>　　2.4.7.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響</p><p>　　以發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麩皮、全麥粉作為碳源，按5%的接種量接種，28℃培養(yǎng)60h

65、后，收集發(fā)酵液離心取上清液測酶活，研究不同碳源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，確定最佳碳源。 </p><p>　　2.4.7.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響</p><p>　　以發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以尿素、蛋白胨、硝酸銨、脲、硫酸銨、氯化銨作為氮源，按5%的接種量接種，28℃培養(yǎng)60h后，收集發(fā)酵液離心取上清液測酶活，研究不同氮源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，確定最佳氮源。&l

66、t;/p><p>　　2.4.8 培養(yǎng)基優(yōu)化</p><p>　　把含有兩個(gè)以上因素的試驗(yàn)稱為多因素試驗(yàn)。多因素試驗(yàn)由于要考慮的因素較多，當(dāng)每個(gè)因素的水平數(shù)較大時(shí)，若進(jìn)行全面試驗(yàn)，則試驗(yàn)次數(shù)將會(huì)更大。因此，對于多因素試驗(yàn)，存在一個(gè)如何安排好試驗(yàn)的問題。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究和處理多因素試驗(yàn)的一種科學(xué)方法，它利用一套現(xiàn)存規(guī)格化的表——正交表，來安排試驗(yàn)，通過少量的試驗(yàn)，獲得滿意的試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)碳源

67、、氮源對產(chǎn)酶量的影響，確定最佳碳源、氮源為培養(yǎng)基優(yōu)化的兩個(gè)因素。由于鎂離子是淀粉酶活性中心的激活劑，所以定為一個(gè)優(yōu)化的因素；真菌發(fā)酵與細(xì)菌發(fā)酵的條件等各不相同，即發(fā)酵初始pH值也可作為培養(yǎng)基優(yōu)化的因素之一。加之影響菌種生長等因素較多，故選擇影響較大的作為正交試驗(yàn)的因素。</p><p>　　確定的4個(gè)因素，留一組為空白對照，選擇五因素四水平的正交表。正交試驗(yàn)因素表如表4。</p><p>

68、　　表4 正交水平因素表</p><p>　　選擇L16-4-5正交實(shí)驗(yàn)表。如下：</p><p>　　表5 正交實(shí)驗(yàn)表（L16-4-5）</p><p>　　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的直觀分析就是要通過計(jì)算，將各因素、水平對試驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)的影響大小，通過極差分析，綜合比較，以確定最優(yōu)化試驗(yàn)方案的方法.有時(shí)也稱為極差分析法.</p><p>&

69、lt;b>　?。?） 極差計(jì)算</b></p><p>　　在代表因素A的第1列中，將與水平“1”相對應(yīng)的第1，2，3號3個(gè)試驗(yàn)結(jié)果相加，記作T11，求得T11。同樣，將第1列中與水平“2”對應(yīng)的第4，5，6號試驗(yàn)結(jié)果相加，記作T21，求得T21。</p><p>　　一般地，定義Tij為表9-21的第j列中，與水平i對應(yīng)的各次試驗(yàn)結(jié)果之和(i=1，2，3；j=1，2，3

70、，4).記T為9次試驗(yàn)結(jié)果的總和，Rj為第j列的3個(gè)Tij中最大值與最小值之差，稱為極差。</p><p>　　顯然T=，j=1，2，3，4.</p><p>　　此處T11大致反映了A1對試驗(yàn)結(jié)果的影響，</p><p>　　T21大致反映了A2對試驗(yàn)結(jié)果的影響，</p><p>　　T31大致反映了A3對試驗(yàn)結(jié)果的影響，</p>

71、;<p>　　T12，T22和T32分別反映了B1，B2，B3對試驗(yàn)結(jié)果的影響，</p><p>　　T13，T23和T33分別反映了C1，C2，C3對試驗(yàn)結(jié)果的影響，</p><p>　　T14，T24和T34分別反映了D1，D2，D3對試驗(yàn)結(jié)果的影響.</p><p>　　Rj反映了第j列因素的水平改變對試驗(yàn)結(jié)果的影響大小，Rj越大反映第j列因素影

72、響越大。</p><p>　　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的極差分析簡便易行，計(jì)算量小，也較直觀，但極差分析精度較差，判斷因素的作用時(shí)缺乏一個(gè)定量的標(biāo)準(zhǔn).這些問題要用方差分析解決。</p><p>　　設(shè)有一試驗(yàn)，使用正交表Lp(nm)，試驗(yàn)的p個(gè)結(jié)果為y1，y2，…，yp，記</p><p><b>　　T=， =，</b></p>&l

73、t;p><b>　　ST=</b></p><p>　　為試驗(yàn)的p個(gè)結(jié)果的總變差；</p><p><b>　　Sj=</b></p><p>　　為第j列上安排因素的變差平方和，其中r=p/n.可證明</p><p><b>　　ST=</b></p>&

74、lt;p>　　即總變差為各列變差平方和之和，且ST的自由度為p-1，Sj的自由度為n-1.當(dāng)正交表的所有列沒被排滿因素時(shí)，即有空列時(shí)，所有空列的Sj之和就是誤差的變差平方和Se，這時(shí)Se的自由度fe也為這些空列自由度之和.當(dāng)正交表的所有列都排有因素時(shí)，即無空列時(shí)，取Sj中的最小值作為誤差的變差平方和Se.</p><p>　　從以上分析知，在使用正交表Lp(nm)的正交試驗(yàn)方差分析中，對正交表所安排的因素選

75、用的統(tǒng)計(jì)量為：</p><p><b>　　F=.</b></p><p>　　當(dāng)因素作用不顯著時(shí)，</p><p>　　F~F(n-1，fe)，</p><p>　　其中第j列安排的是被檢因素.</p><p>　　在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，先求出各列的Sj/(n-1)及Se/fe，若某個(gè)Sj/(n-1)比

76、Se/fe還小時(shí)，則這第j列就可當(dāng)作誤差列并入Se中去，這樣使誤差Se的自由度增大，在作F檢驗(yàn)時(shí)會(huì)更靈敏，將所有可當(dāng)作誤差列的Sj全并入Se后得新的誤差變差平方和，記為SeΔ，其相應(yīng)的自由度為feΔ，這時(shí)選用統(tǒng)計(jì)量</p><p>　　F= ~F(n-1，feΔ).</p><p>　　2.4.9 淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的研究</p><p>　?。?）酶反應(yīng)的最適溫度：

77、將酶溶于pH 6.0的磷酸緩沖液中，在20℃，37℃，50℃，60℃，70℃80℃，90℃溫度內(nèi)，不同溫度下測定酶活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力；</p><p>　?。?）酶的熱穩(wěn)定性：將酶溶于pH6.0的磷酸緩沖液中，在20℃，37℃，50℃，60℃，70℃80℃，90℃這些不同溫度下處理30min時(shí)間后，分別測定酶活力，以未經(jīng)熱處理的酶所測得的活力為100%，計(jì)算相對酶活力；</p>

78、;<p>　　（3） 酶反應(yīng)的最適pH：將酶溶于pH范圍為4.0～8.4之間，不同pH的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液中，于最適反應(yīng)溫度下測定酶活力。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力；</p><p>　?。?）酶的酸穩(wěn)定性：將酶溶于pH范圍為4.0～8.4之間，不同pH的磷酸緩沖液中，在室溫下放置不同時(shí)間后，測定酶活力。以未放置于4℃下保存的酶所測得的活力為100%，計(jì)算相對酶活力。</p&g

79、t;<p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定</p><p>　　由圖1可見，淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線呈一條直線，當(dāng)可溶性淀粉濃度在0～0.01%范圍內(nèi)時(shí)，隨著淀粉濃度的增加，淀粉與碘液顯色后的光吸收值OD620。線性增加，因此當(dāng)測定溶液中淀粉濃度時(shí)，只要顯色后的光吸收值OD620在圖中的直線范圍內(nèi)就可以參

80、照標(biāo)準(zhǔn)曲線比較準(zhǔn)確的計(jì)算出被測溶液的淀粉濃度。</p><p>　　表 6 淀粉濃度梯度曲線結(jié)果</p><p>　　圖1 淀粉濃度與吸光度相關(guān)性曲線</p><p>　　3.2 菌種篩選結(jié)果</p><p>　　實(shí)驗(yàn)在初篩固體培養(yǎng)基中共獲得野生菌株8株，顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)為真菌。這些菌株經(jīng)過復(fù)篩液體養(yǎng)基發(fā)酵，選著發(fā)酵液酶活最高的

81、菌株T-1，重命名為CH1，該菌株的固體培養(yǎng)基菌落形態(tài)在生長初期為淡黃色菌絲邊緣與中心顏色一致，后期單菌落邊緣不整齊，表面黃褐色干粉狀，無褶皺。</p><p>　　表7 不同菌株產(chǎn)酶能力</p><p>　　注：T-3、T-6、T-8菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中消耗底物可溶性淀粉較少，本實(shí)驗(yàn)方法測不出。</p><p>　　3.3 菌種顯微觀察結(jié)果</p>

82、<p>　　圖2 為CH1 在40倍物鏡下觀察用棉蘭染液染色營養(yǎng)菌絲的結(jié)果。菌絲形態(tài)分明，細(xì)胞之間的連接清晰可見。</p><p>　　圖2 CH1 顯微鏡下的菌絲</p><p>　　圖3 為顯微鏡下發(fā)現(xiàn)較為完整的菌絲結(jié)構(gòu)，圖中曲霉的足細(xì)胞明顯清晰，分生孢子梗較為粗壯，分生孢子與頂囊顏色深淺不一，從圖中能依稀辨別出初生小梗和次生小梗的結(jié)構(gòu)形態(tài)。</p>&l

83、t;p>　　圖 3 CH1 顯微鏡下的菌體結(jié)構(gòu)</p><p>　　3.4 發(fā)酵過程不同時(shí)間產(chǎn)酶量的測定結(jié)果</p><p>　　由復(fù)篩培養(yǎng)基接種發(fā)酵檢測其發(fā)酵過程中淀粉酶活力。結(jié)果（圖 4）表明在39h之后，CH1開始分泌產(chǎn)生淀粉酶，酶活較小，產(chǎn)酶一直持續(xù)到51h，采用本實(shí)驗(yàn)方法可檢測出較為準(zhǔn)確值，一直持續(xù)到60h后產(chǎn)酶量到峰值，且一直到66h保持穩(wěn)定，因此60～66h之間可

84、停止發(fā)酵收集產(chǎn)物。</p><p>　　表 8 發(fā)酵不同時(shí)間測得酶活</p><p>　　圖 4 發(fā)酵過程不同時(shí)間相對酶活曲線</p><p><b>　　3.5培養(yǎng)基優(yōu)化</b></p><p>　　3.5.1 碳源對產(chǎn)淀粉酶活力的影響： </p><p>　　碳源是構(gòu)成菌體的碳

85、架及能量的來源，真菌細(xì)胞于重的一半是由碳組成的。碳源在真菌生長過程中占有很重要的地位。在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變不同的碳源，檢測CH1菌株的產(chǎn)酶情況。由圖5可以看出，不同碳源對CH1產(chǎn)淀粉酶有一定的影響，其中以麩皮為碳源時(shí)產(chǎn)酶量最佳。因此，本試驗(yàn)以麩皮作為液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的最佳碳源。</p><p>　　圖 5 不同碳源發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶活力的比較</p><p>　　3.5.2 氮源

86、對產(chǎn)淀粉酶活力的影響：</p><p>　　氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的重要組成成分。不同氮源對淀粉酶的產(chǎn)生有不同程度的促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)測試了不同氮源對CH1菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，其結(jié)果如圖 6所示。結(jié)果表明以蛋白胨為氮源所獲酶活最大。</p><p>　　圖 6 不同氮源發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶活力的比較</p><p>　　3.5.3 正交法優(yōu)化培養(yǎng)基：</p

87、><p>　　選擇5因素4水平正交試驗(yàn)結(jié)果如表8：</p><p>　　表 8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　對以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析結(jié)果如表9：</p><p>　　表9 正交試驗(yàn)結(jié)果處理a</p><p>　　根據(jù)極差分析因素的主次順序?yàn)椋?lt;/p><p>　　主 →

88、 次</p><p>　　麩皮； 硫酸鎂、其他 、pH ；蛋白胨</p><p>　　較好的組合水平為A3B3C3D3E4，即麩皮含量2%，蛋白胨含量1%，硫酸鎂含量0.04%，初始pH值6.0。 </p><p>　　對以上的結(jié)果進(jìn)行方差分析，表8 中第5列為空列，因此Se=S5=0.031，其中，fe=3+0=3，所以Se/fe=0.0103，而第2,4列

89、的S2=0.004，S2/f2=0.0013，S4=0.025，S4/f4=0.0083比Se/fe小，故將它并入誤差。</p><p>　　SeΔ=Se+S2+S4=0.06，feΔ=9。整理成方差分析表10。</p><p>　　表10 正交試驗(yàn)處理結(jié)果b </p><p>　　由于F0.05(1,3)=3.86，F(xiàn)0.01(1,3)=,6.99。故因素：麩

90、皮作用高度顯著，因素：蛋白胨作用不顯著，因素：硫酸鎂，pH作用顯著，這與前面極差分析的結(jié)果是一致的。</p><p><b>　　3.6酶學(xué)性質(zhì)研究</b></p><p>　　3.6.1 溫度對淀粉酶的影響：</p><p>　　在不同溫度條件下測定淀粉酶促淀粉水解速率，結(jié)果表明(圖 7)隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速率增高，在60℃時(shí)酶促反應(yīng)速

91、率達(dá)到最大，即淀粉酶活力達(dá)到最高；當(dāng)溫度超過70℃以后，酶促反應(yīng)速率迅速下降，即酶活力降低。因此認(rèn)為，該淀粉酶的最適酶促反應(yīng)溫度為60℃。酶熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖 8)表明淀粉酶在20～60℃持續(xù)處理0.5 h后，酶促反應(yīng)速率并無明顯下降，仍保持在95%以上。</p><p>　　圖 7 酶的最適反應(yīng)溫度</p><p>　　圖 8 酶的熱穩(wěn)定性</p><p>

92、　　3.6.2 pH對淀粉酶的影響：</p><p>　　將淀粉酶粗酶液置于由不同pH緩沖液配制的轉(zhuǎn)化體系中，測定不同pH對淀粉酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖 9所示，在pH值為4.4-7.0之間時(shí)，酶促反應(yīng)速率最大，即最適pH為4.4-7.4。將淀粉酶粗酶液分別置于一系列不同的pH的緩沖液，室溫放置1h，然后轉(zhuǎn)入酶活測定體系中檢測保留酶活力。以未放置時(shí)的酶活為100%。結(jié)果表明，酶在pH 5.0-7.0之間相對穩(wěn)定

93、，超過此范圍酶活力受pH影響下降較為顯著（圖10）。</p><p>　　圖 9 酶反應(yīng)的最適pH值</p><p>　　圖 10 酶的酸堿穩(wěn)定性</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本課題從不同來源的曲以及其他來源的菌株中篩選得到淀粉酶的高產(chǎn)菌株，命名為CH1，通過對其菌絲體的顯

94、微觀察對其進(jìn)行分類，鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。</p><p>　　CH1產(chǎn)的淀粉酶在培養(yǎng)基優(yōu)化后淀粉酶活力為101.686u/mL，相對原來的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的酶活有較大的提高。在pH值為4.4～7.4范圍內(nèi)保持高酶活，該酶在70℃時(shí)仍有較高酶活，有一定的耐熱性，最適反應(yīng)溫度為60℃，在20℃，37℃和50℃，60℃保溫30min酶活性基本沒有損失，80℃下保溫30min幾乎沒有酶活性；該酶在pH值

95、為5.0～7.0范圍內(nèi)保存30min后再按照實(shí)驗(yàn)酶活測定法測酶活，仍有95%以上的相對活性，具有很好的耐酸性。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孫曉菲,李愛江.α-淀粉酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀.[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2008(6):13-14.</p><p>　　[2] 張雙民.土壤中淀粉酶高產(chǎn)菌株的分

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97、-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究.[D].四川大學(xué),2006.06</p><p>　　[6] 崔福綿.我國微生物酶在食品方面的應(yīng)用.[J].中國食品工業(yè),1995,(10)16.</p><p>　　[7] 羅志剛,楊景峰,羅發(fā)興.α-淀粉酶的性質(zhì)及應(yīng)用.[J].食品研究與開發(fā),2007.(l28):163-165</p><p>　　[8] 王慧超,陳今朝,韓

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103、/b></p><p><b>　　淀粉酶的研究進(jìn)展</b></p><p><b>　　1. 淀粉酶簡介</b></p><p>　　淀粉酶是催化淀粉、糖原轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，廣泛應(yīng)用于淀粉工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒等行業(yè)[1]。淀粉酶是最早用于工

104、業(yè)化生產(chǎn)的酶，迄今為止仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一[2]。</p><p>　　不同種類的淀粉酶水解淀粉會(huì)生成不同的產(chǎn)物。常見的淀粉酶可以分為以下幾種：α-淀粉酶（EC3.2.l.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（EC3，2.1.3），也叫γ -淀粉酶，簡稱糖化酶（縮寫GA或G）：異淀粉酶（EC3.2.1.68）等[3]。α-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖

105、、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為α構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘度下降；β-淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，其產(chǎn)物還原性末端葡萄糖單位碳原子為β構(gòu)型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解α-l，4糖苷鍵和分支的α-1，6-糖苷鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6糖苷鍵，切下側(cè)枝鏈[5]。</p><p>　　對淀粉酶的分類和作用機(jī)制研究較

106、多，可按來源、產(chǎn)物的旋光度、作用機(jī)制等進(jìn)行分類。但近年隨著酶學(xué)性質(zhì)的研究的發(fā)展，對酶的作用機(jī)制、方式等研究不斷取得新成果，分類學(xué)問題出現(xiàn)許多難點(diǎn)。我國在食品方面研究和應(yīng)用的微生物酶估計(jì)有30多種[6]，其中淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶、環(huán)糊精生成酶等。</p><p>　　2. 淀粉酶的生產(chǎn)</p><p>　　2.1 淀粉酶的來源</p&g

107、t;<p>　　淀粉酶的來源很廣泛，可以來自于植物、動(dòng)物以及微生物。大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的兩種淀粉酶為α-淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于植物中的β-淀粉酶也存在于少量微生物中。</p><p>　　α-淀粉酶可以從幾種細(xì)菌、真菌和酵母中分離獲得。但是，由于細(xì)菌淀粉酶具有幾個(gè)比較優(yōu)良的特性，因此，細(xì)菌淀粉酶用的比較多，特別是淀粉液化芽孢桿菌已用于工業(yè)化生產(chǎn)[5]。</

108、p><p>　　不像其他的淀粉酶，微生物僅產(chǎn)生少量的β-淀粉酶，有桿菌（假單孢桿菌和梭狀芽孢桿菌）等。</p><p>　　葡糖淀粉酶具有多種來源，植物、動(dòng)物及微生物，但是，商業(yè)上所用的葡糖淀粉酶也是來源于微生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要來源。</p><p>　　2.2 淀粉酶的生產(chǎn)</p><p>　　淀粉酶的生產(chǎn)主要有兩種

109、方法，即液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。由于固態(tài)發(fā)酵具有經(jīng)濟(jì)上和工程上的優(yōu)點(diǎn)，因此人們常常采用這種方法生產(chǎn)淀粉酶?！　?lt;/p><p>　　2.2.1 α-淀粉酶的生產(chǎn)</p><p>　　桿菌是α-淀粉酶的最重要的來源而且可以用于酶的生產(chǎn)。解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可以生產(chǎn)耐熱的α-淀粉酶，同時(shí)也可以進(jìn)行生產(chǎn)酶及淀粉的水解[5]。</p><p>　　在乳清、玉米漿以及大

110、豆粉的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一些簡單而又便宜的培養(yǎng)基用于α-淀粉酶的生產(chǎn)，這種培養(yǎng)基也可以進(jìn)一步開發(fā)成為工業(yè)生產(chǎn) α-淀粉酶用的培養(yǎng)基。一些研究表明，不同的碳源會(huì)影響α-淀粉酶的產(chǎn)量，乳糖、葡聚糖及可溶性淀粉有利于酶的產(chǎn)量的提高，當(dāng)使用葡萄糖時(shí)，酶的產(chǎn)量非常高。溶氧率也是α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)的一個(gè)重要的因素，高的溶氧率可以產(chǎn)生大量的酶。</p><p>　　絲狀真菌是胞外酶的最大的生產(chǎn)者，因此，用這些菌來生產(chǎn)α-淀粉酶也

111、引起人們的興趣，嗜熱真菌是α-淀粉酶最好的生產(chǎn)菌，調(diào)節(jié)其生長條件和培養(yǎng)基成分，可以使酶的產(chǎn)量增加。</p><p>　　固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也用于α-淀粉酶的生產(chǎn)，用這種技術(shù)可以極大地提高酶的產(chǎn)量，如將地衣芽孢桿菌固定在膜上，生產(chǎn)的α-淀粉酶比游離細(xì)胞產(chǎn)量多176%。</p><p>　　2.2.2 β-淀粉酶的生產(chǎn)</p><p>　　如前所述，β-淀粉酶主要來源