1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質(zhì)量與

2、安全 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b><

3、;/p><p><b>　　0 前言14</b></p><p>　　1 材料與方法15</p><p>　　1.1實驗材料15</p><p>　　1.1.1原料來源15</p><p>　　1.1.2酶制劑15</p><p>　　1.1.3 儀器與設備15&l

4、t;/p><p>　　1.1.4 試劑15</p><p>　　1.2測定方法15</p><p>　　1.2.1 酶活的測定15</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測定15</p><p>　　1.3工藝流程16</p><p>　　1.4操作要點16</p&g

5、t;<p>　　1.4.1 原料預處理16</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白16</p><p>　　1.5 試驗方法17</p><p>　　1.5.1 酶及提取介質(zhì)的選擇17</p><p>　　1.5.2 復合酶的復合比確定17</p><p>　　1.5.3 酶提取的單

6、因素實驗17</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實驗17</p><p>　　2 結果與分析18</p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含量的測定結果18</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標準曲線的繪制18</p><p>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果18<

7、/p><p>　　2.2酶活測定結果19</p><p>　　2.3酶及提取介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響19</p><p>　　2.4復合酶的不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響20</p><p>　　2.5酶提取的單因素實驗結果20</p><p>　　2.5.1料液比對牛皮膠原蛋白提取率的影響20<

8、;/p><p>　　2.5.2酶提時間對牛皮膠原蛋白提取率的影響21</p><p>　　2.5.3 酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響22</p><p>　　2.5.4加酶量對牛皮膠原蛋白提取率的影響23</p><p>　　2.5.5乙酸濃度對牛皮膠原蛋白提取率的影響23</p><p>　　2.6酶提取的最

9、佳工藝條件正交實驗結果24</p><p><b>　　3 結論25</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻25</b></p><p>　　附 錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：膠原蛋白具有良好的

10、物理性能和生物學特性，因而應用于化工、食品、醫(yī)學等諸多領域。本文以牛肉制品的下腳料——牛皮為原料，以膠原蛋白提取率作為指標，比較水和0.5mol/L的乙酸溶液兩種不同的介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響，得出采用酸酶結合法更利于牛皮膠原蛋白的提取。此外，在酶的選擇上通過比較試驗，最后選擇復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）作為試驗用酶。在此基礎上，本實驗又通過單因素試驗和正交試驗對牛皮酶解工藝條件進行了優(yōu)化，實驗結果表明酶提取

11、的最優(yōu)條件為：以0.5mol/L的乙酸溶液為提取介質(zhì)，料液比（m/V）為1:25，酶提溫度為42℃，酶提時間為8h，加酶量為3000U/g，牛皮膠原蛋白的提取率高達90.56%。</p><p>　　關鍵詞：牛皮；酶解；膠原蛋白；復合酶</p><p>　　Abstract: Due to collage’s many favorable physical and biological c

12、haracteristics, it has a wide range of applications in many areas.In this paper, fresh cowhide as raw material and the extraction rte of collagen as index, the enzymic extract method combing with acetic acid is considere

13、r a wonderful method and greatly improves the rate, when comparing the enzymic extract method combing with water. On the choice of the enzymes, the compound enzyme that the pepsin and the papain are compounded by </p&

14、gt;<p>　　Keywords: Cowhide; enzymatic extraction; collagen; the compound enzyme</p><p><b>　　0 前言</b></p><p>　　膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)[1]。膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白在脊椎動物體內(nèi)

15、占蛋白質(zhì)總量25%-30%，占腱和骨骼的細胞外蛋白質(zhì)總量90%以上，其中動物皮中膠原蛋白含量達到50%以上[2]。膠原蛋白是結締組織極重要的結構蛋白質(zhì)，是動物結締組織中的骨、軟骨、皮膚、腱、韌等的主要成分，對機體和臟器起著支持、保護、結合以及形成界隔等作用[3-4]。</p><p>　　膠原蛋白是細胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，分子量為300ku左右。膠原蛋白最普遍的結構特征是三螺旋結構，其由3條α-鏈多肽組成

16、，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，3條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結構形成膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩(wěn)定[5]。結構決定性質(zhì)，性質(zhì)決定用途。正由于膠原蛋白獨特的結構，使得膠原蛋白具有獨特的生物學性能和重要的生理作用。膠原蛋白具有低免疫原性，生物相容性，可生物降解性等[6]，另外還具有止血，修復皮膚骨骼以及美容保健等作用[7]。膠原蛋白結構的多樣性和復雜性決定其在許多領域的重要地位，因而膠原蛋白產(chǎn)品具有良好的應用前景。如在

17、生物醫(yī)學上，膠原蛋白具有能夠自發(fā)將體外膠原蛋白組裝成各種緊密結構的能力，因而是作為組織工程支架、醫(yī)用敷料系統(tǒng)和藥物輸送工具的潛在材料[8-9]。同時，目前有學者還開始研究膠原蛋白的其他功能，如在去除自由基和降血壓等[10]方面的研究。</p><p>　　由于膠原蛋白的諸多優(yōu)點，因此膠原蛋白的提取一直是研究的熱點。膠原蛋白的提取方法通常有酸法、堿法、酶法以及酸、酶結合法和堿、酶結合法等方法[11-12]。在幾種膠

18、原蛋白的提取方法中，酸法提取迅速而徹底，但是一些氨基酸會被破壞，如絲氨酸和酪氨酸部分被破壞，同時提取率較低；堿法提取速度很快，但是膠原蛋白結構被破壞，產(chǎn)生消旋作用，同時含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞；酶法提取提取對膠原蛋白破壞性小，能更好更完全地得到活性蛋白[13]。同時，隨著生物技術水平的提高，酶制劑的來源廣泛，活性也不斷提高，價效比也大幅度降低，為其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用提供了極大空間，特別是蛋白酶制劑應用已不少見，并取得明顯成效。因

19、此，酶法提取膠原蛋白是膠原蛋白生產(chǎn)的一個方向[14]。但是，一般酶法的水解率不徹底，提取率一般較低，因而目前采用酸酶結合或者堿酶結合來提取膠原蛋白。</p><p>　　同時，就目前的消費趨勢來看，我國膠原蛋白的需求量逐漸增加，特別是隨著人們對飲食和健康的不斷重視，因此市場前景較為關闊。另一方面在肉制品和制革加工過程中含有富含膠原物質(zhì)的副產(chǎn)物（皮、內(nèi)臟、肉骨頭），但是其利用的附加值很低。利用這些廢棄物生成膠原蛋白

20、，既實現(xiàn)資源的合理和有價值利用，又實現(xiàn)經(jīng)濟和社會效益的雙贏。本實驗以牛肉制品的下腳料--牛皮為原料，采用酶解法提取牛皮中俄膠原蛋白，同時通過試驗條件的優(yōu)化，得到較優(yōu)的提取條件，為今后的進一步研究提供參考。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1實驗材料</b></p><p>

21、;<b>　　1.1.1原料來源</b></p><p>　　新鮮牛皮：寧波萊盛農(nóng)業(yè)科技實業(yè)有限公司提供</p><p><b>　　1.1.2酶制劑</b></p><p>　　胃蛋白酶 生化試劑 Amresco</p><p>　　木瓜蛋白酶 生化

22、試劑 國藥試劑</p><p>　　1.1.3 儀器與設備</p><p>　　HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司</p><p>　　DHG-9140AS型電熱鼓風干燥箱 寧波江南儀器廠</p><p>　　Acculab ALC

23、210.3電子天平 Acculab公司</p><p>　　T-6新銳可見分光光度計 北京普析通用有限責任公司</p><p>　　RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西分析儀器廠</p><p>　　PB-10pH計

24、 德國sartorius 公司</p><p>　　其他：電冰箱，錐形瓶，試管，燒杯等。</p><p><b>　　1.1.4 試劑</b></p><p>　　L-羥脯氨酸 生化級 上海潤成生物科技有限公司</p>

25、<p>　　高氯酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　正丙醇 分析純 國藥試劑</p><p>　　高氯酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　異丙醇

26、 分析純 國藥試劑</p><p>　　檸檬酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　乙酸鈉 分析純 國藥試劑</p><p>　　氯胺T 分析純 國藥試劑&l

27、t;/p><p>　　硫酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　對二甲基苯甲醛 分析純 國藥試劑</p><p>　　其他為實驗室常規(guī)試劑</p><p><b>　　1.2測定方法</b></p><

28、;p>　　1.2.1 酶活的測定</p><p>　　酶活力測定：按照中華人民共和國專業(yè)標準SB/T10317-1999《蛋白酶活力測定法》測定。</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測定</p><p>　　1.2.2.1實驗原理</p><p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等，其中羥脯氨酸

29、是膠原蛋白的特有氨基酸，在膠原蛋白中含量固定，通常為10%左右。不同來源的生物膠原蛋白含量不同，因此換算系數(shù)也不同。例如，水生生物一般采用11.1，周愛梅等[15]在研究淡水魚膠原蛋白提取優(yōu)化工藝研究中就采用11.1作為換算系數(shù)。而郭恒斌、曾慶祝[16]在研究酶法提取魷魚皮膠原蛋白工藝條件中采用14.2作為換算系數(shù)。查閱相關的資料[17]，在本實驗中決定取10.0作為牛皮中膠原蛋白的換算系數(shù)。膠原蛋白的含量按公式（1.1）計算：<

30、/p><p>　　牛皮中膠原蛋白的含量﹦羥脯氨酸含量×10.0 （公式1.1）</p><p>　　1.2.2.2羥脯氨酸標準曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測定》的方法繪制標準曲線，空白對照用蒸餾水替代，過程同前。</p&

31、gt;<p>　　1.2.2.3樣品處理與羥脯氨酸的測定</p><p>　　準確稱取4g牛皮原料于錐形瓶中，量取30mL左右配置好的3mol/L硫酸溶液加入錐形瓶中，用表面皿蓋住，置于105℃干燥箱內(nèi)水解16h。水解結束后用濾紙趁熱將水解液過濾到250mL的容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度。按照GB/T9695.23-2008測定稀釋后的樣品溶液中羥脯氨酸的濃度，樣品中的提取出的羥脯氨酸含量計算按公

32、式（1.2）計算：</p><p>　　W＝(F×C×V×10-3) (公式1.2)</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　C—標準曲線上相應的羥脯氨酸濃度，μg/mL；

33、</p><p>　　W—提取出的羥脯氨酸含量，mg/g；</p><p>　　V—稀釋后溶液的總體積，mL；</p><p>　　M—稱取樣品的質(zhì)量，g；</p><p><b>　　F—稀釋倍數(shù)。</b></p><p>　　1.2.2.4膠原蛋白提取率的測定</p><p

34、>　　將酶解后的溶液進行離心收集上清液，測定上清液體積，并從上清液中吸取5.0mL于錐形瓶中，分別加入5.0mL3mol/L的硫酸并用表面皿蓋住，放入105℃烘箱中水解16h，將水解液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容至刻度；吸取5.0mL上述溶液定容至100mL。其余各步按GB/T9695.23-2008測定其羥脯氨酸測定法操作[18]。提取率的計算公式為：</p><p>　　提取率（%）＝溶液中羥脯氨酸的濃度

35、×體積×稀釋倍數(shù)/牛皮中羥脯氨酸的含量×100% （公式1.3）</p><p><b>　　1.3工藝流程</b></p><p>　　新鮮牛皮→原料整理→原料預處理→酶法提取牛皮膠原蛋白→膠原蛋白提取率測定</p><p><b>　　1.4操作要點</b></p>

36、<p>　　1.4.1 原料預處理</p><p>　　1.4.1.1去脂肪</p><p>　　在對原料進行酶解之前，一般需要對原料進行預處理。脫脂是預處理的一部分。提取膠原蛋白的過程中，需要盡可能的去除脂肪組織。因為在膠原蛋白中一旦有脂質(zhì)的混入以后不管是進行中性還是酸性溶解都很難把脂肪去除，最后得到乳濁狀的膠原蛋白，最終影響產(chǎn)物的純度[19]。查閱資料，通常使用的脫脂方法

37、有有機溶劑浸泡脫脂[16]與碳酸鈉浸泡脫脂。本實驗采用6%碳酸鈉溶液浸泡脫脂20h。</p><p>　　1.4.1.2去雜蛋白 </p><p>　　在原料預處理中，除了要對原料去脂肪外，還需要對原料進行去雜蛋白。從查閱的資料[15]來看，在提取膠原蛋白過程中用得最多的除雜蛋白試劑是氯化鈉溶液。本實驗以5%氯化鈉溶液為去牛皮雜蛋白溶液，按1:15混合，室溫下浸泡12小時除去鹽溶性非膠原

38、成分，再用清水沖洗牛皮數(shù)次去除殘留氯化鈉，瀝干后搗碎備用。</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白</p><p>　　將預處理好的碎牛皮置于某種提取介質(zhì)，以一定的料液比進行混合，加入適量的酶，在適宜的溫度下酶提一定時間。酶提結束后，將酶解液離心收集上清液進行提取率的測定。</p><p><b>　　1.5 試驗方法</b><

39、;/p><p>　　1.5.1 酶及提取介質(zhì)的選擇 </p><p>　　將預處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，以水為介質(zhì)，分別加入3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測定提取率。其中胃蛋白酶的pH調(diào)節(jié)為2.5。</p><p>　　再以相同的量稱取預處理的牛皮原料三份

40、，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，分別加入加酶量為3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測定提取率。對這兩組實驗比較后，選擇合適的提取介質(zhì)和酶。</p><p>　　1.5.2 復合酶的復合比確定</p><p>　　將預處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，分別加入加酶量為3000U/g的復合

41、酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）、復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:2酶活比例復合）、復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按2:1酶活比例復合），以10.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，料液比為1:25，溫度為37℃，提取8h后測定提取率，選擇合適的復合比。</p><p>　　1.5.3 酶提取的單因素實驗 </p><p>　　1.5.3.1 料液比的選擇</p>&l

42、t;p>　　根據(jù)以上確定的0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，以及實驗所得的復合酶作為試驗用酶，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，在37℃下，加酶量為3000U/g，提取時間為8h,分別以1：15，1:20,1:25，1:30，1:35的料液比下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同料液比對牛皮膠原蛋白的提取率影響，選定最適的料液比。</p><p>　　1.5.3.2 酶提時間的選擇</p>

43、<p>　　根據(jù)以上確定的料液比，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，在37℃下，加酶量為3000U/g,分別以4，6，8，10，12的酶提時間下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同酶提時間牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提時間。</p><p>　　1.5.3.3 酶提溫度的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比和酶提時間

44、，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取七份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，加酶量為3000U/g，分別以4℃，15℃，27℃，32℃，37℃,42℃,47℃的酶提溫度下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提溫度。</p><p>　　1.5.3.4 復合酶添加量的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比、浸提時間和浸提溫度下，將預處理

45、的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，分別以1000U/g、2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g的加酶量下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同的復合酶添加量對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的加酶量。</p><p>　　1.5.3.5 乙酸濃度的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比、浸提時間、浸提溫度和加酶量下，將預處理的

46、牛皮原料以相同的量稱取五份，分別以0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L的乙酸濃度下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同的乙酸濃度對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的乙酸濃度。</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實驗</p><p>　　在單因素試驗的基礎上，以膠原蛋白的提取率為指標采用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，其因素與

47、水平見表1.1，按L9(34)正交表進行正交試驗。</p><p>　　表1.1正交試驗因素水平表</p><p>　　Tab1.1The factors and levels of orthogonal experiment</p><p><b>　　2 結果與分析</b></p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含

48、量的測定結果</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標準曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測定》的方法，以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖2.1.</p><p>　　圖2.1羥脯氨酸標準曲線</p><p>　　Fig.2.1The standard c

49、urves of hydroxyproline</p><p>　　如圖2.1所示，羥脯氨酸標準樣品的回歸方程為y＝0.2014x﹢0.001，y為吸光度值，x為羥脯氨酸的濃度。羥脯氨酸濃度與光密度值幾乎呈直線相關（R2＝0.9999）。因此，由此標準回歸方程計算羥脯氨酸濃度準確可靠。</p><p>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果</p><p>　　

50、將牛皮按1.2.2.3的方法處理后，于558nm處測定其吸光值，從標準曲線上查出其相應的濃度，按照公式（2.2）計算出牛皮中羥脯氨酸的含量，結果見表2.1。</p><p>　　從表2.1中可知，牛皮中羥脯氨酸含量的平均值為2.87%。羥脯氨酸為膠原蛋白的特異氨基酸，根據(jù)公式（1.1）計算牛皮中膠原蛋白的含量。計算可得膠原蛋白的平均含量為28.7%，占牛皮總質(zhì)量的1/4以上。</p><p&g

51、t;　　表2.1牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果</p><p>　　Tab.2.1 The content of hydroxyproline in cattle skin</p><p><b>　　2.2酶活測定結果</b></p><p>　　根據(jù)中華人民共和國專業(yè)標準SB/T10317-1999《蛋白酶活力測定法》，實驗測得所用胃蛋白酶的

52、酶活力為3.78×103U/g，木瓜蛋白酶的酶活力為6.63×103U/mg。</p><p>　　2.3酶及提取介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　實驗中分別采用水和0.5mol /L乙酸溶液作為提取介質(zhì)，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）三種酶作為試驗酶，在加酶量為3000U/g，溫度為37℃，提取時間為8h

53、，料液比為1:25下提取牛皮中的膠原蛋白。提取結束后，按照1.4.3的方法測定牛皮中膠原蛋白的提取率，比較酶和提取介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.2。</p><p>　　圖2.2酶及提取介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.2 Effect of enzyme and medium on extraction of collagen</p>

54、;<p>　　不同的酶對牛皮酶解效果的影響很大。在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被用來提取動物組織中的膠原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶提取膠原蛋白的報道。本實驗中選擇了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合酶來提取牛皮中的膠原蛋白。從圖2.2可以看出，在以水為介質(zhì)中，木瓜蛋白酶的提取率比胃蛋白酶的提取率略高。這與王川、李燕、馬志英等[20]在研究不同酶對豬皮膠原蛋白提取率的影響的結果一致。同時，從圖中所示，復合酶的提取率比木瓜蛋白酶與胃

55、蛋白酶的提取率低很多。分析原因可能為：一方面，復合酶提取時的pH值適合木瓜蛋白酶的酶解作用，但是不適合胃蛋白酶的發(fā)揮作用。根據(jù)文獻[21～22]查得，胃蛋白酶作用的最適pH值在1.5～2.5之間，木瓜蛋白酶對酶解作用最適pH為5.而復合酶提取時的pH值為中性，因而胃蛋白酶的活性受抑制。另一方面，復合酶中的木瓜蛋白酶含量比第二組的木瓜蛋白酶含量低。</p><p>　　而以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質(zhì)時，胃

56、蛋白的提取率高于木瓜蛋白酶的提取率，這與所查得文獻[14]一致。可能原因為0.5mol /L的乙酸溶液pH在2～3之間，接近于胃蛋白酶的最適pH，利于胃蛋白酶發(fā)揮作用；而對于木瓜蛋白酶而言，此環(huán)境略偏酸性，會使木瓜蛋白酶的作用有所抑制。此外，從圖中很明顯看出，復合酶的提取率最高，與以水介質(zhì)時的情況相反。可能原因是一開始時，胃蛋白酶活性較高，發(fā)揮作用；隨著酶解過程的進行，溶液pH有所升高，使得木瓜蛋白酶活性增強，兩種酶一起作用，使得酶解效

57、果更佳，膠原蛋白提取率得到提高。因此以下實驗選擇復合酶作為實驗的酶制劑。</p><p>　　同時，不同的提取介質(zhì)對酶解效果也存在著影響。目前，在酶解法提取膠原蛋白中，一般結合酸性條件下進行酶解。根據(jù)查閱的文獻[23]，通過酸性膨脹并結合酶的作用，既可以保證膠原蛋白結構的完整性，又可以提高膠原蛋白的提取率。因此，本次實驗中分別以水和0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，比較不同的提取介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影

58、響。由圖2.2可知，以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質(zhì)時的提取率遠遠高于以水作為介質(zhì)時的提取率。因此，以下實驗中選擇0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)。</p><p>　　2.4復合酶的不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　將預處理的牛皮原料分為三份，分別加入不同復合比的復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶分別按1:1，1:2，2:1酶活比例復合），在以0.5mol/

59、L乙酸溶液為提取介質(zhì)，加酶量為3000U/g，料液比為1:25，，溫度為37℃，提取時間為8h下進行牛皮膠原蛋白的提取，研究不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響，結果如圖2.3.</p><p>　　圖2.3復合酶的復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.3 Effect of different compound proportion on extraction

60、 of collagen</p><p>　　從圖2.3中，可以看出，木瓜蛋白酶與胃蛋白酶酶活比為1:1復合時提取率最高，因此確定復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合，以下統(tǒng)稱為復合酶）作為酶制劑來提取牛皮中的膠原蛋白。</p><p>　　2.5酶提取的單因素實驗結果</p><p>　　2.5.1料液比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p>

61、<p>　　以0.5mol/L的乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，浸提時間為8h，溫度為37℃下，考察不同料液比對牛皮膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.4。</p><p>　　圖2.4料液比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.4 Effect of different solid-liquid ratio on extraction of col

62、lagen</p><p>　　由圖2.4可知，料液比（m/V）在1：15～1:35范圍內(nèi)，隨著提取介質(zhì)的增加，提取率不斷增加，當料液比在1:25時達到最大值；但當提取介質(zhì)繼續(xù)增加時，提取率開始緩慢降低。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是隨之提取介質(zhì)的增加，底物濃度隨之降低。當?shù)孜餄舛容^高時，提取一段時間后溶液中膠原蛋白達到較大值，但是溶液較粘稠，必然會影響膠原蛋白的溶解；當?shù)孜餄舛冉档偷揭欢ǔ潭群?，溶液較稀，對膠原的繼續(xù)溶

63、解影響較小；同時酶與底物的接觸機率降低，酶與底物的作用減少使得提取率降低[24]。因此，從提高提取率、減少醋酸溶液用量和降低后續(xù)操作負荷的角度考慮，料液比控制在1:25左右。總體上看，料液比對提取率的提高不是很明顯。</p><p>　　2.5.2酶提時間對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　以0.5mol/L的乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，溫度為37℃，料液比為1:2

64、5（m/V），研究不同酶提時間對牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.5。</p><p>　　由圖2.5可知，在前8h內(nèi)隨酶提時間延長，膠原蛋白提取率增加較快，超過8h提取率增加緩慢。分析原因：當提取時間較少時，牛皮中的膠原蛋白還沒有完全溶解到溶液中，因此隨著時間的增加膠原蛋白的提取率也會增加；膠原蛋白的提取率達到某一極限值后，再增加提取時間，膠原的提取率也不會有明顯的增加[20]。因此，為縮短提取工藝周期，

65、提高生產(chǎn)效率，提取時間應控制在8h以內(nèi)。</p><p>　　圖2.5 酶提時間對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.5 Effect of different immersion time on extraction of collagen</p><p>　　2.5.3 酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p&

66、gt;　　確定酶提時間為8h，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，料液比為1：25（m/V），研究不同酶提溫度對牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.6。</p><p>　　圖2.6 酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.6 Effect of different immersion temperature on extraction

67、 of collagen</p><p>　　由圖2.6可知，當溫度在30℃以下時，隨著溫度的增加提取率相應增加，但是增加速率較慢；當溫度在30～40℃左右，隨著溫度的增加，提取率增加較快；到超過40℃后，增加速率比較緩慢。分析原因：根據(jù)查得文獻得，胃蛋白酶的最適溫度在37℃，木瓜蛋白酶的最適溫度在60℃。當溫度低于30℃時，兩種酶的活性受到抑制，無法正常發(fā)揮作用；當溫度在30～40℃左右，達到胃蛋白酶的最適溫度

68、，同時靠近木瓜蛋白酶的最適溫度，因此提取速率增加加快；當溫度超過45℃后，可能部分胃蛋白酶失活，同時膠原蛋白也可能發(fā)生變性，因此增加速率較緩慢。從提高提取率兼顧節(jié)省成本角度考慮，可選用42℃作為提取溫度。</p><p>　　2.5.4加酶量對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　以42℃作為酶提溫度，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，確定酶提時間為8h，料液比為1：25（m/V）

69、，研究不同加酶量對牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.7。</p><p>　　從圖2.7所示，隨著加酶量的增加，膠原蛋白的提取率增加速率較快；當達到3000U/g時，達到最大值；但當加酶量繼續(xù)增加時，增加很緩慢，幾乎在同一條直線上。分析原因：當加酶量較小時，底物濃度相對較大，足以使酶飽和，在此種情況下，反應速度與酶濃度成正比，因此，當酶用量增加時，酶解反應的速度隨之增加，提取率增加較快；當酶用量增加到一定程

70、度后，底物濃度不足以使酶飽和，在增加酶用量也不會使反應速度明顯增加,這與查得的文獻[25]類似。故從節(jié)約成本的角度考慮，復合酶的加酶量選擇在3000U/g。</p><p>　　圖2.7 加酶量對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.7 Effect of different enzyme concentration on extraction of collagen&

71、lt;/p><p>　　2.5.5乙酸濃度對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在加酶量為3000U/g，酶提溫度為42℃，酶提時間為8h，料液比為1：25（m/V）下，研究不同乙酸濃度對牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.8。</p><p>　　從圖2.8所示，不同的乙酸濃度會影響牛皮中膠原蛋白的提取率。乙酸濃度在0.5～0.7mol/L時，提取率較高

72、，低于0.5mol/L或者高于0.7mol/L時，提取率有所降低。分析原因：當乙酸濃度低于0.5mol/L時，pH值有所提高，適合木瓜蛋白酶的作用，但是不適合胃蛋白酶發(fā)揮作用，提取率有所限制；當高于0.7mol/L，酸性較強，木瓜蛋白酶活性受抑制，提取率無法提高；總體上而言，乙酸濃度對牛皮中膠原蛋白提取率的影響不是很明顯。在本實驗中，從乙酸用量的角度和提取率的角度，選擇0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)。</p>&l

73、t;p>　　圖2.8 乙酸濃度對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.8 Effect of acetic acid concentration on extraction of collagen</p><p>　　2.6酶提取的最佳工藝條件正交實驗結果</p><p>　　在單因素試驗的基礎上采用正交試驗對酶解工藝進行優(yōu)化，按L9(34

74、)正交表進行正交，結果見表2.2。</p><p>　　表2.2正交試驗的結果與分析</p><p>　　Tab.2.2 The results analysis of orthogonal experiment</p><p>　　從表2.2可以看出，三個因素對膠原蛋白提取率的影響依次為C＞＞A＞B,優(yōu)化所得條件為：A3B2C3，即酶提溫度為47℃，酶提時間為8h

75、，加酶量為4000U/g。但從極差分析的三個平均值（k值）來看，溫度的后兩個水平相差不大，同時從經(jīng)濟與實際應用的角度考慮，酶提溫度應選42℃，酶提時間為8h,加酶量為4000U/g.通過驗證實驗，測得在此條件下酶提牛皮中膠原蛋白的提取率為90.56%。</p><p><b>　　3 結論</b></p><p>　　3.1 實驗結果表明，牛皮中羥脯氨酸的含量為2.

76、87%，膠原蛋白的含量為28.7%，占牛皮總重量的1/4以上。</p><p>　　3.2 實驗中比較水和0.5mol/L的乙酸溶液兩種不同的介質(zhì)對牛皮膠原蛋白提取率的影響，得出采用酸酶結合法更利于牛皮膠原蛋白的提取。</p><p>　　3.3 在酶的選擇上，實驗中分別比較胃蛋白酶、木瓜蛋白酶這兩種單酶與復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）的膠原蛋白提取效果，得出復合酶更

77、利于牛皮膠原蛋白的提取。同時，實驗中探索了復合酶不同的復合比對膠原蛋白提取率的影響，最后選擇復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）作為試驗用酶。</p><p>　　3.4 在單因素和正交實驗的基礎上并結合實際綜合考慮，得到最佳的酶解工藝條件為：以0.5mol/L的乙酸溶液為提取介質(zhì)，料液比（m/V）為1:25，酶提溫度為42℃，酶提時間為8h，加酶量為3000U/g，膠原蛋白的提取率為90.56%。

78、</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 李二鳳, 何小維, 羅志剛.膠原蛋白的提取工藝研究[J] . 食品研究與開發(fā), 2006, (27) : 64-67.</p><p>　　[2] 付強. 膠原高得率提取法及膠原膜性能的研究[C] . 四川大學碩士學位論文. 四川 : 四川大學, 2006 : 2-5.

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