1、蜱是一種常見(jiàn)的動(dòng)物體表寄生蟲(chóng),在生物分類(lèi)學(xué)上屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、蛛形綱、蜱螨目、后氣門(mén)亞目、蜱總科。它們?cè)谑澜绺鞯貜V泛分布,侵襲哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)以及兩棲類(lèi)等動(dòng)物,是僅次于蚊子的第二大疾病傳播媒介,嚴(yán)重危害著人和動(dòng)物的健康。為了持續(xù)地吸血,蜱的唾液腺分泌大量的生物活性分子。這些生物活性分子包含抗凝血分子,免疫調(diào)節(jié)分子,粘合劑蛋白分子,毒素,抗菌多肽等。它們?cè)隍鐚?duì)抗宿主凝血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和傳播病原體等方面發(fā)揮著重要的作用。為探索新型蜱及蜱傳

2、疾病防治策略,鑒定并研究蜱唾液腺重要生物活性分子的功能是重要內(nèi)容,本研究針對(duì)鐮形扇頭蜱的抗凝血分子開(kāi)展研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了鐮形扇頭蜱吸血前后的唾液腺抑制消減雜交cDNA文庫(kù),并從cDNA文庫(kù)中克隆出兩個(gè)具有Kunitz結(jié)構(gòu)域的抗凝血分子編碼基因,命名為Rhipilin-1和Rhipilin-2基因。在此基礎(chǔ)上,本研究以pFastbae HTA為表達(dá)載體,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒Rhipilin-1-pFastbaeHTA

3、、Rhipilin-2-pFastbac HTA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10 Bac中,抽提重組桿粒Rhipilin-1-Bacmid、Rhipilin-2-Bacmid,將重組桿粒轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行真核表達(dá),并采用間接免疫熒光和Western blotting的方法對(duì)重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行了鑒定。結(jié)果分別獲得了大小為24.5kDa的Rhipilin-1重組蛋白和大小為28.3kDa的Rhipilin-2重組蛋白。對(duì)重組蛋白R(shí)hipi

4、lin-2進(jìn)行了抗凝血活性試驗(yàn)和酶活性抑制試驗(yàn),結(jié)果表明,重組Rhipilin-2蛋白,可以顯著延長(zhǎng)兔血的部分凝血酶活化時(shí)間,具有抗凝血活性。重組Rhipilin-2蛋白的酶活性抑制實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)屬于絲氨酸類(lèi)蛋白的人彈性蛋白酶、胰蛋白酶的抑制作用明顯,并具有濃度依賴(lài)特性。
　　 本研究還應(yīng)用了RNA干擾技術(shù),研究了二個(gè)抗凝血分子Rhipilin-1和Rhipilin-2的生物學(xué)功能。用含有T7啟動(dòng)子的方法在體外合成dsRNA,分別

5、以顯微注射的方式注射到蜱體內(nèi),干擾Rhipilin-1和Rhipilin-2目的基因,觀(guān)察基因干擾后,對(duì)蜱吸血的生物學(xué)特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Rhipilin-1和Rhipilin-2基因后,和對(duì)照組相比較,鐮形扇頭蜱的24小時(shí)吸附率和飽血重量都明顯下降,表明二個(gè)分子在維持蜱正常吸血的過(guò)程中具有重要作用。
　　 綜上所述,本研究用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)鐮形扇頭蜱抗凝血基因Rhipilin-1和Rhipilin-2進(jìn)行了真核表達(dá),并對(duì)