1、位于革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌染色體上的hrp基因簇決定其在非寄主植物上的過敏反應(yīng)和在寄主植物上的致病性。Hrp基因簇包括編碼Ⅲ型泌出通道的基因、調(diào)節(jié)基因和編碼效應(yīng)蛋白的基因。Harpins是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生并受hrp基因調(diào)節(jié)的一類非特異性激發(fā)子，具有共同的特征：富含甘氨酸、對(duì)熱穩(wěn)定對(duì)蛋白酶K敏感。它們通過Ⅲ型泌出通道分泌到細(xì)胞膜外并轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主植物的細(xì)胞質(zhì)中，能夠在寄主植物上引起致病性，在非寄主植物上引起過敏反應(yīng)，誘導(dǎo)植物抗病，

2、抗蟲，促生長(zhǎng)以及提高作物的產(chǎn)量與改善作物品質(zhì)。HarpinXoo是由水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzaepv.oyzae的hrf1基因編碼的蛋白質(zhì)，大小為139個(gè)氨基酸(15.6kDa)，具有與其它harpins類似的生物學(xué)活性，但在結(jié)構(gòu)和組成上，它顯示一些其它harpins不具有的獨(dú)特性質(zhì)，如含有其它harpins不具備的半胱氨酸等。
　　 植物擁有一套天然的免疫系統(tǒng)，使得它們能夠抵御外界病原物的侵染。高等植物的

3、HR，快速在病原物侵染點(diǎn)形成壞死斑，死亡細(xì)胞可以將侵入寄主體內(nèi)的病原物限制在侵染點(diǎn)周圍，阻止病原物的進(jìn)一步擴(kuò)展而實(shí)現(xiàn)局部抗病性，是植物針對(duì)多種病原物的主動(dòng)防御，可進(jìn)一步激活植物抗病防衛(wèi)信號(hào)通路，使植物獲得對(duì)此后侵入的多種類型病原物的系統(tǒng)抗病性（systemic acquired resistance， SAR）。當(dāng)harpin被注射到非寄主植物葉片中時(shí)，最顯著的特征就是引起過敏反應(yīng)，而harpin的活性位點(diǎn)是如何被植物細(xì)胞識(shí)別，在什么部

4、位識(shí)別，目前還不清楚。在本研究中，我們引入了一種研究植物-病原菌互作的新方法，應(yīng)用基于Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說制備出的單克隆抗獨(dú)特型抗體模擬harpin的活性位點(diǎn)，探索harpin在非寄主植物中受體。本論文著重對(duì)以下幾方面進(jìn)行了研究。
　　 1 HarpinXoo蛋白的提取與純化
　　 在本研究中，作者從水稻白葉枯病菌PXO99基因組DNA中擴(kuò)增出hrf1基因，用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，隨后插入到到pET30a(+)

5、載體的NdeⅠ和HindⅢ兩酶切位點(diǎn)之間，獲得了重組質(zhì)粒pET30a(+)-hrf1，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)表達(dá)融合蛋白。表達(dá)菌株E.coli BL21/pET-hrf1在37℃，225rpm經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)后收集菌體，在100℃沸水中煮10分鐘，提取HarpinXoo蛋白，離心分離菌體，蛋白溶解在提取緩沖液中。SDS-PAGE電泳分析表明，獲得了大小為16.8kDa蛋白質(zhì)。注射煙草葉片，引起過敏反應(yīng)，說明提取到的

6、蛋白為Harpin。用Ni柱對(duì)粗蛋白進(jìn)行純化，最終獲得了單一條帶的Harpin蛋白。
　　 2兔源多克隆抗-Harpinxoo抗體(Ab1)的制備與純化
　　 500μg純化的HarpinXoo溶解于滅菌的PBS中，與等體積的福氏完全佐劑混合乳化后皮下多點(diǎn)注射與肌肉注射交叉免疫新西蘭大白兔，隨后的加強(qiáng)免疫用200μg抗原與福氏不完全佐劑混合乳化，每?jī)芍苊庖咭淮?。六周后，采集兔血清用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)，以免疫前三天采

7、集的陰性血清作對(duì)照。ProteinA/G親合層析柱純化兔源多克隆抗血清，獲得多克隆抗-HarpinXooIgG。HarpinXoo注射煙草引起的過敏反應(yīng)能被兔源多克隆抗體Ab1抑制，甚至完全阻止，說明Ab1結(jié)合harpin的一個(gè)或多個(gè)活性位點(diǎn)，而這些活性位點(diǎn)可能是非寄主植物中受體的結(jié)合位點(diǎn)。
　　 3體外、體內(nèi)都具有抑制活性的單克隆抗-Harpinxoo抗體的制備
　　 Balb/c小鼠接受四次免疫注射純化的Harpin

8、Xoo后，選取效價(jià)最高的一只小鼠做融合，制備雜交瘤細(xì)胞。間接ELISA法篩選，有限稀釋法亞克隆，兩輪篩選后獲得6株單克隆抗HarpinXo雜交瘤細(xì)胞(2A10、3H12、4B2、4F7、6G4、7F11)。ELISA疊加實(shí)驗(yàn)表明，HarpinXoo上的四個(gè)表位被6株單克隆細(xì)胞株所識(shí)別，其中被6G4識(shí)別的表位為HarpinXoo引起煙草過敏反應(yīng)活性位點(diǎn)。體外研究表明，6G4能夠與煙草葉片總蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合HarpinXoo，最重要的是在體

9、內(nèi)，6G4能夠部分抑制HarpinXoo引起的煙草過敏反應(yīng)。6G4顯然為一個(gè)非常合適的免疫原來制備具有Harpinxoo活性位點(diǎn)“內(nèi)影像”特征的抗獨(dú)特型抗體。闡明6G4在體外、體內(nèi)的反應(yīng)特性將有助于鑒定引起煙草過敏反應(yīng)的harpin的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 4具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨(dú)特型抗體的制備與特性分析
　　 用固定化的胃蛋白酶消解純的兔源多克隆抗體Ab1獲得F(ab＇)2片段，具有抗原結(jié)合活性的F(ab

10、＇)2被用作免疫原來制備具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨(dú)特型抗體。為制備單克隆抗獨(dú)特型抗體Ab2,F(ab＇)2片段和福氏佐劑乳化后免疫小鼠。隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠血清中抗獨(dú)特型抗體的濃度也在增加。Ab2能夠抑制Ab1與harpin的結(jié)合，當(dāng)抑制率達(dá)到50％時(shí)，三只小鼠血清的稀釋倍數(shù)分別為：鼠1(917)＜鼠2(1094)＜鼠3(2540)。因此我們選取競(jìng)爭(zhēng)抑制效果最好的小鼠3進(jìn)行細(xì)胞融合。
　　 應(yīng)用間接ELISA

11、法和競(jìng)爭(zhēng)抑制ELSIA法篩選具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨(dú)特型抗體。用間接ELISA法初步篩選，獲得224株抗Ab1的陽性克隆，進(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)ELSIA法篩選，抑制率達(dá)到50％以上的細(xì)胞株僅獲得23株。經(jīng)過第一輪篩選，具有全部抗獨(dú)特型抗體的特征并能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株6B2被篩選出來。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明，6B2與Ab1的結(jié)合受harpin抑制，但不受其它無關(guān)蛋白如：BSA抑制，這進(jìn)一步可以說明6B2與Ab1的結(jié)合位點(diǎn)可能為

12、獨(dú)特型結(jié)合位點(diǎn)。6B2與HarpinXoo競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合非寄主植物中推定的harpin受體，這是本研究的關(guān)鍵所在。6B2與受體的結(jié)合位點(diǎn)和harpin與受體的結(jié)合位點(diǎn)可能為同一個(gè)活性位點(diǎn)或非常相近的活性位點(diǎn)。6B2與非寄主植物中推定受體的結(jié)合可能是交叉反應(yīng)的結(jié)果，或者受體構(gòu)象發(fā)生改變結(jié)果，然而，也有可能是兩種機(jī)制共同作用的結(jié)果。6B2免疫新西蘭大白兔進(jìn)一步誘導(dǎo)出與兔源多克隆抗體Ab1相同或相似活性的Ab3，這就佐證了我們制備的抗獨(dú)特型抗體

13、6B2確實(shí)具有HarpinXoo的“內(nèi)影像”特征。這些結(jié)果表明，6B2具有抗原相似性，即，抗獨(dú)特型抗體6B2可以充當(dāng)HarpinXoo抗原的“內(nèi)影像”，因此，根據(jù)Jeme的系統(tǒng)命名法，6B2可以歸類為Ab2β。
　　 總之，應(yīng)用抗獨(dú)特型抗體進(jìn)行抗原模擬是探索生物體內(nèi)含量非常低的受體的一種可行方法。這種方法涉及到多種學(xué)科，如：蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、免疫學(xué)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作，其應(yīng)用也是非常廣泛的，如：功能模擬，用作探針鑒定受體和免疫