1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p><b>　　雨生紅球藻色素分析</b></p><p>　　一、選題的背景與意義</p

2、><p>　　蝦青素是發(fā)現(xiàn)于某些水生動物體內(nèi)的一種酮式類胡蘿卜素，又名蝦黃素，是一種具有極強抗氧化活性的類胡蘿卜素，超強的抗氧化活性賦予了蝦青素突出的生理功能，如提高動物免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧等。蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價值，不僅可以用作水產(chǎn)養(yǎng)殖的餌料添加劑、人的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域也有非常大的應(yīng)用潛力。雨生紅球藻是一種單細胞淡水綠藻，其在多種不適宜生長的外界環(huán)境條件下都會在細胞

3、核周圍的細胞質(zhì)基質(zhì)中加速積累次生類胡蘿卜素， 其中80%以上為蝦青素及其酯類。雨生紅球藻中蝦青素的積累量可高達細胞干質(zhì)量的4% ，是其他生物蝦青素合成積累量的一到幾個數(shù)量級，是目前首選的天然蝦青素合成生物。</p><p>　　目前蝦青素作為天然色素和生物活性物質(zhì)受到了極大的重視，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場潛力。隨著人們對雨生紅球藻蝦青素認識的逐步清晰以及對蝦青素在雨生紅球藻中積累的分子機制研究如蝦青素合成酶

4、基因應(yīng)答環(huán)境脅迫的表達調(diào)控機制將會是新一輪研究的熱點，也將是根本性地改變雨生紅球藻蝦青素生產(chǎn)限制問題的唯一途徑。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的內(nèi)容</b></p><p>　　利用UPLC-Q-TOF-MS分析系統(tǒng)，建立雨生紅球藻色素的分析方法；利用建立的方法對雨生紅球藻生活周期

5、不同階段進行色素組成及結(jié)構(gòu)分析。</p><p><b>　　主要解決問題：</b></p><p>　　確立雨生紅球藻色素提取方法；</p><p>　　建立雨生紅球藻色素分析方法；</p><p>　　利用建立的方法對雨生紅球藻生活周期不同階段進行色素組成及結(jié)構(gòu)分析，特別是蝦青素及其酯類化合物的結(jié)構(gòu)分析與定量。<

6、;/p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　研究的方法</b></p><p>　　本研究首先收集雨生紅球藻生長周期不同階段的藻樣，即對數(shù)期（綠色或游動孢子期）、綠色向紅色轉(zhuǎn)化時期（即剛開始積累蝦青素時）、不動細胞時期（全部轉(zhuǎn)紅），然后提取色素，最后用高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)對葉綠素、蝦青素及其它類胡蘿卜素進行結(jié)構(gòu)鑒定及

7、定量分析。</p><p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010年11月20-12月15日：更多地收集并閱讀與該課題相關(guān)的中英文資料，對實驗進行設(shè)計并制訂出詳細的研究方案，撰寫開題報告與文獻綜述。</p><p>　　2010年12月15日-2月28

8、日：充分閱讀相關(guān)的文獻，翻譯2篇英文文獻。開始雨生紅球藻的培養(yǎng)和收集實驗。</p><p>　　2011年3月1日-4月15日：建立色素提取方法及色素分析方法，上樣分析，統(tǒng)計分析相關(guān)的數(shù)據(jù)，開始撰寫論文初稿交導(dǎo)師評閱。</p><p>　　2011年4月16日-21日：在導(dǎo)師指導(dǎo)下修改論文，完成二稿，交指導(dǎo)師再次修改。</p><p>　　2011年4月21日-5月

9、2日：查找論文中的不足，完善論文并定稿，參加論文答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] Santos M F, Mesquita J F. Ultrast ructural study of Haematococcus lacust ris ( Girod) ， Rostafinski (Volvocales) .

10、Ⅰ. Some aspects of carotenogenesis [J]. Cytologia, 1984, 49:215-228.</p><p>　　[2] Lee Y K, Soh C W. Accumulation of astaxant hin in Haematococcus lacustris (Chlorophyta) [J] . J Phycol, 1991, 27:575-577.<

11、/p><p>　　[3] Lee Y K, Ding S Y. Effect of dissolved oxygen partialpressure on the accumulation of astaxant hin in chemostat cultures of Haematococcus lacustris (Chlorophy-ta) [J] . J Phycol,1995,31:922-924.<

12、/p><p>　　[4] Boussiba S, Vonshak A. Astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis [J]. Plant Cell Physio, 1991, 32:1077-1082.</p><p>　　[5] Kobayashi M ,Kakizono T. Growth and a

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14、nt hesis by oxidative stress in acetate- in-duced cyst cells of a green unicellular alga ,Haematococcus pluvialis [J] .Appl Environ Microbiol,1993 ,59 : 867-873.</p><p>　　[7] Borowitzka M A ,Huisman J M ,Osb

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23、arotenoid biosynt hesis genes coding for phytoene synt hase and carotenoid hydroxylase during stressinduceastaxant hin formation in the alga Haematococcuspluvialis [J] ,Plant Physiol ,2001 ,125 : 810-817.</p><

24、p>　　[17] Grunewald K,Eckert M ,Hirschberg J ,etal . Phytoene desaturase is localized exclusively in the chloroplast and upregulated at the mRNA level during accumulation of secondary carotenoids in Haematococcus pluvi

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28、cuspluvialis [J] . Journal of Biotechnology ,2006 ,122 :176-185.</p><p>　　[21] Steinbrenner J ,Linden H. Light induction of carotenoid biosynt hesis genes in the green alga Haematococcus pluvialis : regulati

29、on by photosynt hetic redoxcont rol [J] . Plant Mol Biol ,2003 ,52 (2) : 343-356.</p><p>　　[22] 劉建國,孫艷妮,殷明焱等. 無機碳與雨生紅球藻( Haematococcus pluvialis) 細胞調(diào)節(jié)物質(zhì)[J] . 海洋與湖沼,2004,5:459-466.</p><p>　　[23]

30、莊惠如,盧海聲等. 雨生紅球藻營養(yǎng)細胞的蝦青素累積[J] . 水生生物學(xué)報,2001,25 ( 4) : 376-378</p><p>　　[24] M Kobayashi,Y Kurimura,Y Sakamoto et al. Selective extraction of astaxanthin and chlorophyll from the green algaeHaematococcus pluvi

31、alis [J] . Biotechnology Techniques,1997,11 ( 9) : 657-660</p><p>　　[25] 金傳蔭,宋立榮等. 紅球藻水生748株(Haematococcus sp. HB 748) 培養(yǎng)基的選擇與對維生素B12的需求[J] . 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,1997,3 ( 2) : 177-179</p><p><b>　　畢業(yè)

32、論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　雨生紅球藻蝦青素分析</p><p>　　【摘要】蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，具有很強的抗氧化能力。在特定條件下，雨生紅球藻可以積累占其干重1%以上的蝦青素，且所含蝦青素的結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖對象所需一致，被公認為天然蝦青素的最好生物來源。本文將從蝦青素的

33、結(jié)構(gòu)與功能、在雨生紅球藻體內(nèi)的積累機制，提取方法幾方面做簡要介紹。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】蝦青素；雨生紅球藻；結(jié)構(gòu)及功能；積累；提取 </p><p>　　蝦青素是發(fā)現(xiàn)于某些水生動物體內(nèi)的一種酮式類胡蘿卜素，又名蝦黃素，是一種具有極強抗氧化活性的類胡蘿卜素，超強的抗氧化活性賦予了蝦青素突出的生理功能，如提高動物免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧等。蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價值，不僅可

34、以用作水產(chǎn)養(yǎng)殖的餌料添加劑、人的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域也有非常大的應(yīng)用潛力。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細胞淡水綠藻，其在多種不適宜生長的外界環(huán)境條件下都會在細胞核周圍的細胞質(zhì)基質(zhì)中加速積累次生類胡蘿卜素[1]，其中80%以上為蝦青素及其酯類[2] 。雨生紅球藻中蝦青素的積累量可高達細胞干質(zhì)量的4%，是其他生物蝦青素合成積累量的一到幾個數(shù)量級，是目前首選的天然蝦青素合成生

35、物。</p><p><b>　　蝦青素的結(jié)構(gòu)及功能</b></p><p>　　蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，又名蝦黃素，化學(xué)名稱為3 ，3′- 二羥基-4 ， 4′- 二酮基-β，β′-胡蘿卜素， 分子式為C40H52O4 ，相對分子質(zhì)量為596。</p><p>　　1.1 蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)</p><p>　　1.

36、1.1 立體異構(gòu)體</p><p>　　蝦青素有兩個手性(或不對稱)中心，他們是分子中兩端環(huán)結(jié)構(gòu)的C-3 和C-3。一個手性中心可以有兩種構(gòu)象，蝦青素的兩個手性碳原子C-3、C-3′都能以R或S存在，這樣就有3種立體異構(gòu)體：3S、3′S，、3S、3′R 和3R、3′R（見下圖1）。</p><p>　　1.1.2 幾何異構(gòu)體</p><p>　　與C-C雙鍵結(jié)合的原

37、子的排列方式是可以完全不同的，因為原子不能繞雙鍵扭曲或旋轉(zhuǎn)，除非雙鍵斷裂重排。如果兩個基團位于雙鍵的同一側(cè)稱為Z結(jié)構(gòu)，過去稱為順式( Cis) 結(jié)構(gòu)；如果兩個基團位于雙鍵的對應(yīng)面稱為E結(jié)構(gòu)，過去稱為反式( tran) 結(jié)構(gòu)。蝦青素在其分子的線型部分有多個雙鍵，每個雙鍵都可以是Z式或E式，全E結(jié)構(gòu)是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，天然蝦青素中9、13和15位有Z式結(jié)構(gòu)，因此蝦青素可能的幾何異構(gòu)體有全E、(9Z)、(13Z) 、(15Z) 、(9Z

38、、13Z) 、( 9Z、15Z) 、(13Z、15Z) 和(9Z、13Z、15Z) 等。</p><p>　　1.2 蝦青素的功能</p><p>　　1.2.1 抗氧化作用</p><p>　　蝦青素是一類斷鏈抗氧化劑，具有強的抗氧化性能、清除體內(nèi)自由基、延緩衰老的作用。蝦青素可清除NO2、硫化物、二硫化物，也可通過AMVN降低脂質(zhì)過氧化作用，保護蛋黃中磷脂酰膽堿

39、脂質(zhì)免受過氧化基團氧化，整合進膜系統(tǒng)的蝦青素也表現(xiàn)出對脂質(zhì)體的保護作用。蝦青素比β-胡蘿卜素抑制光敏氧化作用的能力強。</p><p>　　1.2.2 抗癌作用</p><p>　　天然類胡蘿卜素具有抗癌作用，蝦青素具有很強的抗癌作用。蝦青素可保護皮膚免受紫外線的損害，作為潛在的光保護劑， 用于阻止皮膚的光老化和防止誘發(fā)皮膚癌。</p><p>　　1.2.3 預(yù)防

40、動脈硬化和相關(guān)疾病</p><p>　　臨床醫(yī)學(xué)研究表明，低密度脂蛋白的氧化是導(dǎo)致動脈硬化的重要原因。蝦青素在體內(nèi)具有顯著升高高密度脂蛋白和降低低密度脂蛋白的功效，而β-胡蘿卜素和角黃素則無此作用，因此推測蝦青素能減輕載脂蛋白的氧化，可用做預(yù)防動脈硬化、冠心病和缺血性腦損傷的制劑。</p><p>　　1.2.4 維護眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的健康</p><p>　　最

41、近的研究表明，蝦青素能通過血腦屏障，有效防止視網(wǎng)膜的氧化和感光器細胞的損傷，說明蝦青素在預(yù)防和治療“年齡相關(guān)性黃斑變性”、改善視網(wǎng)膜功能方面具有良好效果。蝦青素具有保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力，尤其是大腦和脊柱，能有效治療缺血性的重復(fù)灌注損傷、脊髓損傷、Parkinson氏綜合癥、Alzheimer氏綜合癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。</p><p>　　1.2.5 其他應(yīng)用</p><p>　　蝦青素

42、具有最佳誘導(dǎo)細胞分裂的活性和重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為免疫增強劑，提高免疫力。使用蝦青素作為水生動物必需的維生素，對其正常生長和健康養(yǎng)殖， 提高存活率和繁殖率，具有極為重要的作用。蝦青素作為蛋禽和家畜工業(yè)的飼料添加劑，可使禽及家畜的成活率提高，染病率下降，他還可提高禽類卵子的受精率、產(chǎn)蛋率。</p><p>　　蝦青素在雨生紅球藻內(nèi)的積累機制</p><p>　　近年來，國內(nèi)外從與蝦青素

43、合成有關(guān)的誘導(dǎo)條件、紅球藻細胞的光合變化、以及合成酶表達的分子調(diào)控等方面進行了分析研究，目前已經(jīng)有大量相關(guān)的實驗報道。下面分別從幾個方面對目前所取得的進展做一綜述。</p><p><b>　　2.1.1 光照</b></p><p>　　光照是紅球藻誘導(dǎo)蝦青素大量積累最重要的因子，高強度光照下蝦青素的合成會得到促進。許多研究者認為，紅球藻中蝦青素大量合成的誘發(fā)因子可

44、能是光合反應(yīng)引起的氧脅迫，而不是光本身[3 ，4] 。盡管高光照強度是蝦青素合成的重要因子，但光照并不是蝦青素合成的必要條件，在異養(yǎng)條件下沒有光照條件它也能以較慢的速度合成蝦青素[5]。</p><p><b>　　2.1.2 溫度</b></p><p>　　紅球藻適宜的生長溫度為20℃左右，提高溫度有利于紅球藻中蝦青素的積累[6]。Borowitzka等[7]觀察

45、到紅球藻在15℃時基本上全部表現(xiàn)為綠色的游動細胞；培養(yǎng)溫度高到25℃時，有部分細胞轉(zhuǎn)化成積累大量蝦青素的紅色厚壁孢子；而在28 ℃培養(yǎng)20d ，細胞全部轉(zhuǎn)化成了厚壁孢子。Tjahjono等[8]認為高溫促進了活性氧的產(chǎn)生，而活性氧最終有利于蝦青素的高積累。另外也可能是較高的培養(yǎng)溫度抑制了紅球藻細胞的正常分裂生長，從而使蝦青素的相對含量提高。</p><p><b>　　2.1.3 營養(yǎng)鹽</b&g

46、t;</p><p>　　在雨生紅球藻的培養(yǎng)中，氮缺乏會引起紅球藻中蝦青素的大量積累。如在Orosa 等[9]的實驗中，在0 、0. 15 、0. 25 、0. 5 g/ L 等不同NaNO3濃度下每個細胞中的蝦青素合成量分別為24. 5 、5. 5 、0. 6 和0 pg。合成類胡蘿卜素的前體化合物(如甲羥戊酸鹽、丙酮酸鹽) 對蝦青素的合成起促進作用。當(dāng)向紅球藻生長相中加入或多或少的醋酸鹽時，會很快誘導(dǎo)運動細胞

47、向厚壁孢子轉(zhuǎn)變并加速積累蝦青素，但醋酸鹽的濃度對蝦青素的合成量影響不大[10，11 ] ，蝦青素的合成可能受到碳氮比的影響[7] 。二價鐵離子能夠加強醋酸鹽對蝦青素合成的促進作用，這種促進作用不要求蛋白質(zhì)的從頭合成，推測其機理可能是由于Fe2+的加入引起蝦青素合成酶系活化，但這種促進作用受到自由基HO·的猝滅劑KI的抑制。高磷促進蝦青素的合成，高磷對蝦青素積累的促進作用與細胞分裂速度無關(guān)。但其他實驗結(jié)果卻表明：磷缺乏時會引起蝦

48、青素的積累，盡管在此脅迫條件下細胞分裂停止，但這種積累可以一直持續(xù)到細胞停止分裂后21d ，說明在此條件下蝦青素的積累可能不僅與細胞的停止分裂有關(guān)。對這兩種相互矛盾的實驗結(jié)果目前還</p><p><b>　　2.1.4 活性氧</b></p><p>　　很多實驗表明紅球藻中蝦青素的合成與體內(nèi)的活性氧基團有關(guān)。活性氧能促進紅球藻中蝦青素的合成，但這一促進作用是直接導(dǎo)

49、致蝦青素的積累還是一種間接效果目前還沒有足夠證據(jù)。也有大量的實驗可以作為活性氧與蝦青素合成有關(guān)的間接證據(jù)，即誘導(dǎo)蝦青素積累的多種環(huán)境脅迫可以同時誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，如高光強[3] ，干燥[10] ，高鹽[12] ，高溫[9]等。眾多研究者認為蝦青素的合成是紅球藻細胞對逆境產(chǎn)生的氧脅迫的適應(yīng)反應(yīng)。Kobayashi等[13]的實驗中富含蝦青素的厚壁細胞比蝦青素含量較低的游動細胞更能忍耐過量的活性氧，這從另一方面提示了蝦青素可能是應(yīng)氧脅迫而產(chǎn)生

50、的。</p><p>　　2.1.5 細胞分裂抑制劑</p><p>　　Boussiba和Vonshak[3] 為了分析紅球藻的細胞分裂與蝦青素積累之間的關(guān)系，研究了細胞分裂抑制劑長春堿對蝦青素積累的影響。結(jié)果表明，在2mg/ L和5mg/ L的濃度處理下細胞分裂完全被抑制，隨后1～2d單個細胞中蝦青素的含量也隨即開始上升。</p><p>　　2.1.6 其它因

51、素</p><p>　　除以上各影響因素外，干燥[10] 、機械脅迫[14] 等也會促進蝦青素的積累。</p><p>　　2.2 蝦青素積累的分子機制</p><p>　　目前已有人從蝦青素合成酶系基因的表達水平上分析影響蝦青素合成的調(diào)控機制[15-21] 。Steinbrenner和Linden[16]用Northern雜交的方法研究了蝦青素合成酶基因psy和從

52、crtZ在不同環(huán)境脅迫下的表達情況。在最有效的蝦青素誘導(dǎo)條件---同時施加醋酸鈉、硫酸亞鐵和強光照射時，48h內(nèi)psy和從crtZ的mRNA水平都有一個穩(wěn)定的大幅度上升，而蝦青素在誘導(dǎo)72h后達到最高水平(13. 5 mg/ g)。這說明環(huán)境脅迫下蝦青素的合成調(diào)控至少是部分發(fā)生在合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平上。只施加強光照射或只添加醋酸鈉時，該兩酶的mRNA水平也都有一定程度的上升，但轉(zhuǎn)錄量低且轉(zhuǎn)錄較晚，蝦青素的最終積累量也較低，說明高強度光照

53、有利于蝦青素的積累但不是誘導(dǎo)蝦青素積累的唯一和必要條件。在同樣的誘導(dǎo)條件下，光合電子傳遞鏈抑制劑的加入抑制了該兩酶基因的轉(zhuǎn)錄，說明蝦青素的合成還是需要一定的光合量支持。二價鐵離子的添加與否，不影響這兩個酶的mRNA水平，但蝦青素的積累量卻有很大差別，說明Fe2 +對蝦青素合成的影響不發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，這印證了Kobayashi等的研究結(jié)果。同樣，在Grunewal</p><p><b>　　3. 蝦青

54、素的提取</b></p><p>　　根據(jù)雨生紅球藻的生活周期， 主要分為營養(yǎng)細胞和厚壁孢子。一般認為當(dāng)環(huán)境有利時，主要以綠色、能運動的藻體形式存在；當(dāng)環(huán)境不利時，形成厚壁孢子并大量累積蝦青素[23]。雨生紅球藻的厚壁孢子具有堅韌的細胞壁，若直接利用，則其生物有效利用率低，且堅韌的細胞壁也可阻礙有機溶劑進入細胞內(nèi)提取蝦青素[24]。因此在蝦青素提取前必須對孢子態(tài)細胞進行破壁處理，以破壞雨生紅球藻的細胞

55、結(jié)構(gòu)。</p><p>　　3.1 高壓均質(zhì)最佳工藝條件</p><p>　　根據(jù)高壓均質(zhì)原理，通過選定均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)溫度和空列四因素三水平的( L934) 正交設(shè)計表， 研究均質(zhì)條件對細胞破壁率和蝦青素提取率的影響， 以選取最佳均質(zhì)工藝條件。分析結(jié)果表明，均質(zhì)壓力和次數(shù)對破壁率及蝦青素提取率均有較顯著的影響，而均質(zhì)溫度影響不大，可在室溫條件下操作。破壁率和蝦青素提取率均隨均質(zhì)壓

56、力和次數(shù)的增大而增大。經(jīng)過40 MPa、3次均質(zhì)后，雨生紅球藻破壁率可達91.4%。</p><p>　　3.2 超聲波的破壁條件</p><p>　　超聲波破壁常用頻率為15～25kHz。根據(jù)文獻[25]報道，在固定超聲波頻率作用下， 超聲波作用強度和時間是超聲波破壁的主要影響因素。超聲波作用強度和時間對細胞破壁率的影響呈線性關(guān)系，即超聲波強度越大，作用時間越長，破壁率越高。但蝦青素的提

57、取率卻不隨作用強度和時間的增大而增大。在25W最大強度下超聲波作用15～30 min，蝦青素的提取率達到最大值。當(dāng)作用強度超過25W、作用時間超過30min，蝦青素的提取率反而降低。</p><p>　　3.3 冷凍溫度和時間對蝦青素提取率的影響</p><p>　　凍融法也常用于細胞破壁。根據(jù)凍融破壁的主要影響因素，研究結(jié)果表明，冷凍時間和冷凍溫度對蝦青素提取率無明顯影響。</p&

58、gt;<p><b>　　4.　展望</b></p><p>　　目前蝦青素作為天然色素和生物活性物質(zhì)受到了極大的重視，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場潛力。隨著人們對雨生紅球藻蝦青素認識的逐步清晰以及對蝦青素在雨生紅球藻中積累的分子機制研究如蝦青素合成酶基因應(yīng)答環(huán)境脅迫的表達調(diào)控機制將會是新一輪研究的熱點，也將是根本性地改變雨生紅球藻蝦青素生產(chǎn)限制問題的唯一途徑。</p&

59、gt;<p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Santos M F, Mesquita J F. Ultrast ructural study of Haematococcus lacust ris ( Girod) ， Rostafinski (Volvocales) . Ⅰ. Some aspects of carotenogenesis [J].

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81、7,11 ( 9) : 657-660</p><p>　　[25] 金傳蔭,宋立榮等. 紅球藻水生748株(Haematococcus sp. HB 748) 培養(yǎng)基的選擇與對維生素B12的需求[J] . 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,1997,3 ( 2) : 177-179</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><

82、b>　　（20 屆）</b></p><p><b>　　雨生紅球藻色素分析</b></p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　中英文摘要（Abstract）</p><p>　　1.引言...................................

83、......................................................................................................1</p><p>　　2.實驗部分........................................................................................

84、.........................................2</p><p>　　2.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)和處理.......................................................................................2</p><p>　　2.2 儀器與試劑..................

85、.............................................................................................2</p><p>　　2.3 實驗方法...............................................................................................

86、......................3</p><p>　　2.3.1 色譜和質(zhì)譜條件..............................................................................................3</p><p>　　2.3.2 標準溶液的配制..............................

87、................................................................3</p><p>　　2.3.3 樣品處理..........................................................................................................3</p><

88、;p>　　3 結(jié)果與討論............................................................................................................................3</p><p>　　3.1 類胡蘿素及蝦青素酯的分離.........................................

89、....................................................3</p><p>　　3.2 雨生紅球藻色素鑒定.................................................................................................3</p><p>　　3.2.1 游離類胡

90、蘿卜素..............................................................................................................3</p><p>　　3.2.2 蝦青素酯.........................................................................

91、.................................4</p><p>　　3.2.3葉綠素...............................................................................................................6</p><p>　　3.3 雨生紅球藻色素的定量......

92、.......................................................................................6</p><p>　　3.3.1 定量標準曲線、方法檢測限及回收率測定..................................................................6</p><p&

93、gt;　　3.3.2 樣品測定..........................................................................................................6</p><p>　　4 結(jié)論.......................................................................

94、.................................................................7</p><p>　　致謝.................................................................................................................................

95、...........7</p><p>　　參考文獻....................................................................................................................................8</p><p>　　摘要：雨生紅球藻(Haematococcus pl

96、uvialis)是一種單細胞淡水綠藻，其在多種不適宜生長的外界環(huán)境條件下都會在細胞核周圍的細胞質(zhì)基質(zhì)中加速積累次生類胡蘿卜素。本研究旨在建立一種分析鑒定雨生紅球藻色素的方法。液相色譜能夠?qū)⑸馗鹘M分在進入APCI-MS/MS前進行有效的分離，一共鑒定得到5種游離類胡蘿素，15種蝦青素單酯以及2種葉綠素。同時，對提取物中蝦青素各組分進行定量，定量曲線在0~10µg/ml濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.9986，該方法的檢測限為0.0

97、2µg/mL，雨生紅球藻蝦青素回收率達92.47%~98.5%。通過建立的方法對培養(yǎng)的雨生紅球藻色素提取物進行測定，得到蝦青素各組分的相對含量。該方法靈敏、準確，能夠滿足國內(nèi)外的限量要求，可用于蝦青素含量檢驗，對研究雨生紅球藻蝦青素積累機理等意義重大。</p><p>　　關(guān)鍵詞：雨生紅球藻；色素；種類組成；定量分析 </p><p>　　Abstract:Haematococc

98、us pluvialis is a kind of single-celled freshwater algae, whose growth will accelerate the accumulation of secondary carotenoids around the nucleus of the cell matrix under a variety of inappropriate external environment

99、al conditions. The aim of this study was to establish a method for analyzing and identifying pigment in Haematococcus pluvialis . After first being analyzed by HPLC, 5 free carotenoids, 15 astaxanthin monoesters and 2 ch

100、lorophyll in Haematococcus pluvialis wer</p><p>　　Key Words: Haematococcus pluvialis; pigment; specific composition; quantitative analysis </p><p><b>　　1引言</b></p><p>　

101、　雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細胞淡水綠藻，其在多種不適宜生長的外界環(huán)境條件下都會在細胞核周圍的細胞質(zhì)基質(zhì)中加速積累次生類胡蘿卜素，其中80%以上為蝦青素及其脂類[1] 。蝦青素是發(fā)現(xiàn)于某些水生動物體內(nèi)的一種酮式類胡蘿卜素，又名蝦黃素，是一種具有極強抗氧化活性的類胡蘿卜素，超強的抗氧化活性賦予了蝦青素突出的生理功能，如提高動物免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧等。蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價值，不僅可

102、以用作水產(chǎn)養(yǎng)殖的餌料添加劑、人的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域也有非常大的應(yīng)用潛力。雨生紅球藻中蝦青素的積累量可高達細胞干質(zhì)量的4%[2] ，是其他生物蝦青素合成積累量的一到幾個數(shù)量級，是目前首選的天然蝦青素合成生物。</p><p>　　蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，又名蝦黃素，化學(xué)名稱為3 ，3′- 二羥基-4 ， 4′- 二酮基-β，β′-胡蘿卜素， 分子式為C40H52O4 ，相對分子質(zhì)量

103、為596。</p><p>　　蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要為立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體。在立體異構(gòu)體中，因為蝦青素有兩個手性(或不對稱)中心，他們是分子中兩端環(huán)結(jié)構(gòu)的C-3 和C-3。一個手性中心可以有兩種構(gòu)象，蝦青素的兩個手性碳原子C-3、C-3′都能以R或S存在，這樣就有3種立體異構(gòu)體。</p><p>　　在幾何異構(gòu)體中，因為與C-C雙鍵結(jié)合的原子的排列方式是可以完全不同的，因此原子不能繞雙鍵