1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘弧菌群落結構研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 海洋生物資源與

2、環(huán)境 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p

3、><p><b>　　前言1</b></p><p><b>　　1材料與方法1</b></p><p>　　1.1 樣品采集1</p><p>　　1.2培養(yǎng)基錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.3儀器設備錯誤!未定義書簽。</p><p&

4、gt;　　1.4 弧菌的分離、純化錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.5 弧菌基因組DNA的提取及16S rDNA基因的PCR擴增錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.6 弧菌16S rDNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育學分析錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2 結果錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.1弧菌數(shù)量

5、比較錯誤!未定義書簽。</p><p>　　2.2 弧菌群落結構多樣性3</p><p>　　2.2.1 弧菌菌落類型多樣性比較3</p><p>　　2.2.2 弧菌種屬分布多樣性比較4</p><p><b>　　3 討論6</b></p><p>　　3.1 養(yǎng)殖水體弧菌群落結構與

6、病害的關系6</p><p>　　3.2 菌落類型與種屬分布的聯(lián)系7</p><p>　　3.3 弧菌的培養(yǎng)特性及其對實驗的影響8</p><p><b>　　4 展望8</b></p><p><b>　　致謝8</b></p><p><b>　　參考

7、文獻9</b></p><p>　　摘要：采用平板計數(shù)、菌落形態(tài)觀察和16S rDNA序列比對的方法，對健康和發(fā)病的三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）養(yǎng)殖水體的弧菌(Vibrio)數(shù)量和群落結構進行了比較研究。共分離得到42株弧菌，可分為5個菌落類型（C1-C5），6個種。健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量為1.85-2.35×102 cfu/ mL，菌落主要分布在C1、

8、C2和C4這3個類型，分布比較均勻，</p><p>　　V. alginolyticus有6株，為第一優(yōu)勢種，種屬分布也比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量為0.65-1.9×102 cfu/ml，菌落類型主要集中在C1類型，優(yōu)勢種為V. alginolyticus，與健康塘相比，病害塘養(yǎng)殖水體中的弧菌菌落類型和種屬分布均比較集中。這些結果似乎表明三疣梭子蟹發(fā)病與群落結構（比如弧菌的多樣性、致病性弧菌的

9、絕度優(yōu)勢地位）有直接關系，但與弧菌數(shù)量的關系無法從該實驗得到。</p><p>　　關鍵詞：三疣梭子蟹； 養(yǎng)殖水體； 弧菌； 群落結構； 16S rDNA</p><p>　　Abstract: We compare the number and the community structure of the vibrio in the healthy and diseased rearin

10、g water by plate count, colony category and 16S rDNA sequence alignment methods. There are 42 vibrio strains isolated from the rearing water. They can be divided into five groups (C1-C5) by colony category, and 6 species

11、 by sequencing. In the heathy pond, the number of the isolated vibrio is 1.85-2.35 × 102 cfu / mL, mainly contributed in the C1, C2 and C4 groups, V.alginolyticus is the fi</p><p>　　Keywords: Portunus

12、trituberculatus; rearing water; vibrio; community structure; 16S rDNA sequence </p><p><b>　　前言</b></p><p>　　三疣梭子蟹是我國重要的海產經濟蟹類，具有較高的經濟價值。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大、養(yǎng)殖密度的不斷提高、養(yǎng)殖環(huán)境的污染，導致三疣梭子

13、蟹的抗病力下降，容易感染病原體，使得疾病頻繁發(fā)生，例如近幾年由弧菌引起的“乳化病”給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大經濟損失[1]。國外早在20世紀初就有學者[2]對海水魚類弧菌病進行研究，自20世紀60年代后相繼對多種弧菌屬的致病菌有較豐富的研究和報道[3-6]。在三疣梭子蟹大規(guī)模養(yǎng)殖的過程中，由弧菌引起的死亡時有報道[7-8],是該行業(yè)發(fā)展的重要限制性因素。因此研究環(huán)境中弧菌群落結構及數(shù)目規(guī)律，對水產養(yǎng)殖、食品生產等與人類生活及健康密切相

14、關的領域具有重要指導意義。</p><p>　　弧菌屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬，是一類革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運動、無芽胞的短桿狀細菌,其中有的弧菌有一定的彎曲,欠柔軟,有的彎曲不明顯。根據(jù)伯杰氏細菌鑒定手冊(第9版) 收錄的弧菌屬的細菌有37種以上?；【萍毦鷱V泛分布于半咸水、河口、海洋的水體、沉積物中以及海洋生物的體表和腸道中。</p><p>　　目前，有關弧菌相

15、關疾病的病原鑒定、病理和組織生理變化的研究國內已有不少報道如劉淇[9]，王國良[10]，施慧[11]，許文軍[12]，Jang-Seu Ki[13]等分別對上述弧菌相關方面進行了研究，但是目前由弧菌引發(fā)的疾病與水體中弧菌群落結構的關系研究較少，有報道（倪純治等[14] ）過弧菌數(shù)量與蝦體弧菌相關疾病的關系，養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量常常被看做疾病爆發(fā)的重要征兆之一。沿海浮游細菌的基因型容易變異，因此基因類型比較豐富[15]，弧菌主要分布在沿海水

16、域中，也有這個特點?；【N類繁多，致病性菌株只占一小部分（據(jù)相關報道，溶藻弧菌(V. alginolyticus)、哈維氏弧菌（V.harveyi）等10多種弧菌可以引起海水養(yǎng)殖動物發(fā)病[16-17]，特別是夏季，一些弧菌暴發(fā)性增長，使養(yǎng)殖對象出現(xiàn)皮膚潰爛，爛尾，出血等癥狀），大部分是非致病菌，這些非致病菌在水體凈化中還起著非常重要的作用，因此，相較于弧菌數(shù)量，弧菌群落的結構組成可能與疾病爆發(fā)更為相關。</p><p

17、>　　隨著分子生物學技術的發(fā)展，尤其是PCR和測序技術的發(fā)展，使人們能夠利用16S rDNA序列來鑒定環(huán)境中弧菌菌種，來研究環(huán)境中的弧菌群落結構。從環(huán)境中分離純化弧菌，提取各弧菌菌株的DNA，對細菌的16s rDNA區(qū)進行擴增測序，最后通過一些生物信息學的方法鑒定該弧菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。</p><p>　　我們選取兩個代表性的三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘，其中一個塘中梭子蟹發(fā)生類似“牛奶病”的疾病，梭子蟹連續(xù)不斷死亡，

18、稱為病害塘；另一個塘，沒有明顯的梭子蟹死亡跡象，稱為健康塘。我們基于細菌計數(shù)、菌落特征和16S rDNA基因序列比對對這兩個三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘的養(yǎng)殖水體中的弧菌群落組成進行了比較研究，以期進一步揭示弧菌群落結構變化與三疣梭子蟹疾病發(fā)生的關系。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 樣品采集</b>&l

19、t;/p><p>　　2010年7月24日9：30～12：00，寧波鄞州區(qū)瞻岐鎮(zhèn)三疣梭子蟹養(yǎng)殖場，陰雨，氣溫25-31℃，水溫28℃，我們按照《海洋調查規(guī)范》第6部分海洋生物調查（GB/T12763.6-2007）[18] 的要求選取健康不發(fā)病的養(yǎng)殖塘和發(fā)病嚴重的養(yǎng)殖塘各兩個，養(yǎng)殖塘面積為5-6畝，養(yǎng)殖密度為2000只/畝，于水深80cm左右處采取水樣。采樣前，開動水車30 min，以使水體充分混勻。樣品采集后均放在

20、裝有冰袋的密封泡沫箱中，并于6 h內進行實驗。</p><p><b>　　1.2培養(yǎng)基</b></p><p>　　TCBS瓊脂的成分（g/L）[19]：酵母浸出粉5.0 g，蔗糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，枸櫞酸鐵1.0 g，枸櫞酸鈉10.0 g，BTB 0.04 g，硫代硫酸鈉10.0 g，瓊脂粉13.0 g，牛膽粉8.0 g。pH 8.6±0.

21、4</p><p><b>　　1.3儀器設備</b></p><p>　　本實驗所用到的實驗儀器有：Eppendorf 離心機，BIO-RAD PCR儀，變性凝膠電泳儀，瓊脂糖凝膠電泳，RXZ智能型人工氣候箱，SP-DJ系列水平凈化工作臺，-20℃保存的冰箱，水浴鍋，搖床。</p><p>　　1.4 弧菌的分離、純化</p>

22、<p>　　三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘水體的弧菌計數(shù)、分離和純化均采用TCBS培養(yǎng)基。采集的水樣用無菌生理鹽水稀釋成3個梯度（10-1、10-2、10-3 ），每個稀釋度設3個平行,取100 μL稀釋液涂布TCBS培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內連續(xù)培養(yǎng)2～4 d，記錄各平板菌落數(shù)，并推算出原樣品的弧菌濃度，隨機挑取部分單菌落劃線分離純化3次，得到純化菌株用于后續(xù)實驗，記錄其形態(tài)特征，如顏色、質地、表面形態(tài)等。</p>&

23、lt;p>　　1.5 弧菌基因組DNA的提取及16S rDNA基因的PCR擴增</p><p>　　參照張德民等的方法[20] 提取弧菌基因組DNA，并加以改進：菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長后期離心收集菌體，用TE洗滌細胞，重懸于TE中，加溶菌酶0-2 mg/ mL，37 ℃水浴處理5-30 min，加SDS至終濃度為2 % ，60 ℃水浴處理5-60 min，酚/氯仿/異戊醇抽提，氯仿/異戊醇再抽提，乙醇沉淀，溶于

24、去離子水中。采用細菌通用性引物對27f（AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG）和 1541r（ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT）[21]擴增細菌16S rDNA 約1400 bp的片段，并用于測序。采用50 μL PCR反應體系，其組成為：0.2-1 μg基因組DNA，4 μmol·L- 1引物，200 μmol·L- 1 dNTPs，5 μL10×buffer，1 U

25、DNA聚合酶，補雙蒸水到50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；前10個循環(huán)為94 ℃ 1 min，65-60 ℃ l min，72 ℃ 30 s (其中每個循環(huán)后復性溫度下降0. 5 ℃)；后18個循環(huán)為94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30</p><p>　　1.6 弧菌16S rDNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育學分析　</p><p>　　引物對(2

26、7f-1512r) PCR擴增的16S rDNA產物用UNIQ-10柱式通用DNA純化試劑盒純化，送上海生物工程技術服務有限公司進行序列測定，將所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為： GU132526，GU132530，GU132535等。用BLAST程序進行同源性比對，下載相關序列用Mega4.0軟件，再選擇其他幾株已知類別的代表弧菌，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。</p><p><b>　　2 結果&

27、lt;/b></p><p><b>　　2.1弧菌數(shù)量比較</b></p><p>　　對三疣梭子蟹健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體中的弧菌進行菌落計數(shù)（表1），計算出其弧菌濃度，從表中可知，健康塘水體弧菌數(shù)量為1.85-2.35×102 cfu/mL，弧菌的平均數(shù)量為2.1×102 cfu/mL；病害塘水體弧菌數(shù)量為0.65-1.90×1

28、02 cfu/ mL，弧菌的平均數(shù)量為1.3×102 cfu/ mL。</p><p>　　從以上數(shù)據(jù)可以看出，病害塘養(yǎng)殖水體弧菌的樣本1與健康塘在同一數(shù)量級上，比健康塘養(yǎng)殖水體的數(shù)量略少；病害塘養(yǎng)殖水體弧菌的樣本2比健康塘少一個數(shù)量級，數(shù)量幾乎少了一半；從平均數(shù)來看，病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌平均數(shù)量1.3×102 cfu/mL與健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量2.1×102在同一數(shù)量級上，且病

29、害塘的弧菌數(shù)量比健康塘的弧菌數(shù)量僅略少一些。</p><p>　　表1 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體的弧菌數(shù)量（cfu/ml）</p><p>　　Tab.1 The number of vibrio in the rearing water （cfu/ml）</p><p>　　2.2 弧菌群落結構多樣性</p><p>　　2.2.1 弧菌菌落類型

30、多樣性比較</p><p>　　我們從三疣梭子蟹養(yǎng)殖健康塘和病害塘的養(yǎng)殖水體中olond124共分離弧菌42株，其中健康塘水樣與病害塘水樣各21株，首先對其進

31、行劃線純化，經3-5天培養(yǎng)后，記錄其菌落形態(tài)并統(tǒng)計歸類。根據(jù)弧菌菌落特征的差異（如表面形態(tài)、形態(tài)、質地、顏色等）將弧菌菌落初步劃分為5個類型（C1-C5）（見表2）。</p><p>　　從整體上來看，其中C1類型為最優(yōu)勢類型，共有18株菌，占分離菌株總數(shù)的42.9%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有6、12株菌；其次是C2類型，共有12株菌，占分離菌株總數(shù)的28.6%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中

32、分別有7、5株菌；第三是C4類型，共10株，占分離菌株總數(shù)的23.8%，在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有6、4株菌；另外，C2和C5類型的菌株較少，均只有1株菌，均占分離菌株總數(shù)的2.4%，僅分布于健康塘養(yǎng)殖水體中。</p><p>　　分別從健康塘和病害塘養(yǎng)殖塘水體的數(shù)據(jù)可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體均有21株弧菌，健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌菌落分布在5個類型中，其中C2（凸起、奶油、圓、墨綠）有7

33、株菌，為第一優(yōu)勢類型；其次，C1（凸起、奶油、圓、橙黃）和C4（平展、奶油、圓、橙黃）均有6株，為第二優(yōu)勢類型，且僅比第一優(yōu)勢類型相差一株；另外，C3（凸起、蠟狀、圓、墨綠）和C5（平展、蠟狀、圓、橙黃）各一株。病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌菌落類型僅分布在3個類型中，比健康塘少了兩個，其中C1（凸起、奶油、圓、橙黃）有12株，為第一優(yōu)勢類型，且數(shù)量上占有絕對優(yōu)勢；其次，C2（凸起、奶油、圓、墨綠）有5株，為第二優(yōu)勢類型，與第一優(yōu)勢菌相差7株；另

34、外，C4（平展、奶油、圓、橙黃）有4株。</p><p>　　首先，從健康塘和病害塘的弧菌菌落類型多樣性比較可知，健康塘水體的弧菌分布在5個類型中，較病害塘的弧菌分布要廣，健康塘的弧菌主要集中分布在C1、C2和C4這3個類型，第一優(yōu)勢類型為C2，分布比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌分布在3個類型中，主要集中分布在C1類型，C1類型占了病害塘養(yǎng)殖水體分離菌的57.1%，占了病害塘弧菌的一半多，較另外兩個弧菌菌種具有明

35、顯的優(yōu)勢，從這一點可知病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌分布相對比較集中，與健康塘養(yǎng)殖水體不同。</p><p>　　另外，兩者也有共同之處，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的共有類型有3個，分別為C1、C2和C4。從各群落類型的數(shù)量可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體的這3個類型集中了90.5%的弧菌數(shù)量，病害塘養(yǎng)殖水體則集中了全部的弧菌數(shù)量，從這一點來看具有相似性。</p><p>　　表2 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體的弧菌菌落

36、類型分布</p><p>　　Tab.2 The colony category of the vibrio in the rearing water </p><p>　　2.2.2 弧菌種屬分布多樣性比較</p><p>　　我們對分離的弧菌進行16S rDNA鑒定，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體共分離了42株弧菌，實驗過程中死亡5株，DNA提取失敗2株，未鑒定

37、成功2株，實際鑒定33株，16S rDNA序列Blast比對表明33株弧菌歸屬于6個種（98 %的序列相似性作為種的劃分標準）（表3），取該6個種類的代表性菌株和其他6株非代表性菌株的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），比較弧菌種屬在各養(yǎng)殖水體中的分布。</p><p>　　從整體上看，在這6個種類中，V.alginolyticus為最優(yōu)勢種，共有15株菌，占測序弧菌總數(shù)的44.5%，將近一半，其中健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘

38、養(yǎng)殖水體分別有6、9株菌；第二優(yōu)勢種為V.harveyi，共有7株菌，占測序弧菌總數(shù)的21.2 %，其中健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體分別為3、4株菌；第三優(yōu)勢種為V.campbellii和V.natriegens，均有4株菌，均占測序弧菌總數(shù)的12.1 %，其中V.campbellii在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中分別有3、1株菌，V.natriegens在健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體中則均為兩株；其余兩種菌V.neptuniu

39、s和V.xuii的數(shù)量相對較少，僅分布在個別樣品中，為1-2株。</p><p>　　分別從健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的數(shù)據(jù)可以看出，健康塘養(yǎng)殖水體的弧菌共有16株，5個種，其中V.alginolyticus有6株，為第一優(yōu)勢種，V.harveyi有4株，為第二優(yōu)勢種，V.campbellii有3株，為第三優(yōu)勢種，其余的兩個種有1-2株菌，數(shù)量上分布比較均勻；病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌共有17株，6個種，其中V.algin

40、olyticus有9株，，為第一優(yōu)勢種， V.harveyi有3株，為第二優(yōu)勢種，其余4種菌各有1-2株，數(shù)量分布上相對與健康塘來說比較集中，V.alginolyticus的數(shù)量超過病害塘測序弧菌的一半，占有絕對優(yōu)勢。</p><p>　　從健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種屬多樣性比較來看，健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體的差異不是很大，有5個種（V.alginolyticus、V.campbellii、V.harv

41、eyi、V.natriegens和V.neptunius）為兩者所共有，其中V.alginolyticus為健康塘養(yǎng)殖水體和病害塘養(yǎng)殖水體的共有優(yōu)勢種，分別有6、9株菌，占各自塘的測序弧菌總數(shù)的比例為37.5 %、52.9 %，第二優(yōu)勢菌都為V.harveyi，其余3個種在兩塘中的數(shù)量差異也很小。</p><p>　　但是健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種屬分布也有不同之處，病害塘弧菌的分布中第一優(yōu)勢菌為占了一半多的

42、菌種，其數(shù)量占有絕對優(yōu)勢，分布比較集中，而健康塘的弧菌分布相對比較均勻，這一現(xiàn)象與菌落的類型分布特點相似。另外，有1株菌V.xuii僅在病害塘養(yǎng)殖水體出現(xiàn)。</p><p>　　表3 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體弧菌種屬分布</p><p>　　Tab.3 The species distribution of the vibrio in the rearing water</p>&

43、lt;p>　　圖1 三疣梭子蟹養(yǎng)殖水體代表菌株及部分其他非代表弧菌的系統(tǒng)發(fā)育學分析</p><p>　　Fig.1 The phylogenetic analysis of the vibrio in the rearing water and some others</p><p>　　注： 包含的菌株為本實驗從養(yǎng)殖塘分離鑒定的弧菌各菌種的代表菌株，其余為部分其

44、他非代表性弧菌菌株和標準菌株。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　弧菌是海水環(huán)境中的常在菌群，廣泛分布在自然海區(qū)，是一種條件致病菌，當養(yǎng)殖動物受傷、體弱、抗病力降低和環(huán)境條件惡化時，環(huán)境中的部分致病性弧菌就會乘虛而入，引起蟹、蝦等各種水產動物的疾病，嚴重時甚至死亡。本文從弧菌的菌落計數(shù)出發(fā)，通過菌落特征的觀察和弧菌種屬多樣性序比較，對三

45、疣梭子蟹養(yǎng)殖健康塘和病害塘水體的弧菌群落結構進行了比較研究，意在通過兩者的比較，找出養(yǎng)殖塘弧菌群落結構與發(fā)病的關系。</p><p>　　3.1 養(yǎng)殖水體弧菌群落結構與病害的關系</p><p>　　研究證明，大部分病原體在致病前都是處在一種代謝繁殖不活躍或十分不活躍狀態(tài)，疾病的爆發(fā)，是因為病原體數(shù)量激劇增加、病原體的致病力大大加強[22]，本文也證實了這一情況。 V.alginolyti

46、cus為致病性弧菌[23]，在三疣梭子蟹健康塘和病害塘的養(yǎng)殖水體中都存在，并且在病害塘中數(shù)量有較多的增加，成為絕對優(yōu)勢菌種，這可能是引發(fā)三疣梭子蟹疾病的原因之一，另外，菌落分布的結果也有類似現(xiàn)象，病害塘的弧菌種類減少，并且C1（凸起、奶油、圓、橙黃）數(shù)量較健康塘大大增加，成為了絕對優(yōu)勢類型?？偠灾褪钦f在正常情況下，養(yǎng)殖水體中弧菌的種類分布比較均勻，各致病性和非致病性弧菌之間可能存在某種平衡，當這個平衡被打破時，某種或某些致病性弧菌

47、大量繁殖，這些致病性弧菌就比較容易侵入蟹體內，導致疾病的發(fā)生。</p><p>　　弧菌可分為致病性弧菌和非致病性弧菌，且絕大多數(shù)種類為非致病性弧菌，目前已確定的主要的致病性弧菌僅包括霍亂弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌在內的約10種左右[23]，從以上實驗結果我們可以看出，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌在數(shù)量上差別不大，病害塘比健康塘稍微少一些；兩者的弧菌菌落類型分布方面有些差異，健康塘分布比較均勻，而病害塘的弧菌分

48、布比較集中在C1類型；另外，兩者在種屬分布方面的特點與菌落分布相似。因此我們可以推斷，弧菌發(fā)病與養(yǎng)殖水體中弧菌群落結構的變化有直接關系，弧菌數(shù)量有集中到某些致病菌的趨勢，使這些致病菌處于絕對優(yōu)勢地位，從而比較容易侵入蟹體，引起三疣梭子蟹的疾病。</p><p>　　3.2 菌落類型與種屬分布的聯(lián)系</p><p>　　從表4可知，雖然同一種弧菌的菌落特征不是完全分布于同一菌落類型，如V.

49、alginolyticus分布于C1，C2，C4三個類型，V. harveyi分布于C1，C2，C4三個類型。但是每種弧菌都有各自的優(yōu)勢菌落類型，如V. alginolyticus和V. natriegens的優(yōu)勢菌落類型均為C1，分別占各自種屬總菌株數(shù)的80.0 %和75.0 %；另外，V.campbellii有3株菌分布于C2類型，占該種總菌株數(shù)的75.0 % ，V. harveyi的7株菌各有3株分布在C2和C4類型，各占該種總菌

50、數(shù)的42.9 % 從這些結果我們可知，V. alginolyticus的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、橙黃， V.campbellii的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、墨綠，V. natriegens的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、橙黃，V. harveyi的菌落形態(tài)主要為凸起、奶油、圓、墨綠和平展、奶油、圓、橙黃，V. harveyi的種內差別較大，發(fā)育型較多，可能是因為這個原因，所以菌落形態(tài)比較豐富，但具體是由于什么原因，有待進一步實

51、驗驗證。</p><p>　　從上述實驗結果我們可知，養(yǎng)殖水體的弧菌菌落類型中，C1（凸起、奶油、圓、橙黃）為第一優(yōu)勢種群，C2（凸起、奶油、圓、墨綠）為第二優(yōu)勢種群，表4根據(jù)測序弧菌所統(tǒng)計的菌落類型結果顯示也是如此，從該現(xiàn)象我們可以推測，弧菌種屬分布與弧菌菌落類型分布基本一致。我們可以通過菌落類型分布簡單的分析弧菌的群落結構，為實驗結果提供一些參考依據(jù)。</p><p>　　表4 弧菌

52、種屬分布的群落特征</p><p>　　Tab.4 The colony characteristics of different vibro species</p><p>　　3.3 弧菌的培養(yǎng)特性及其對實驗的影響</p><p>　　通過本次實驗，我們還發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，就是弧菌不容易在TCBS瓊脂平板上長期存活，我們分離得到的42株弧菌，在20天后對其進行轉接

53、保種，結果42株弧菌中有20株轉接失敗，對失敗的弧菌再次進行轉接，結果仍然未成功，死亡率有47.6 % ；之后對剩下的22株弧菌，10天后進行轉接，結果轉接成功21株，失敗1株，死亡率為4.5 %；之后對剩下的21株弧菌，15天后進行轉接，結果轉接成功19株，失敗2株，死亡率為9.5 % 一般細菌在培養(yǎng)基上的保存時間為兩個月左右，有些細菌如芽孢桿菌可以保存3個月左右，可是弧菌在TCBS培養(yǎng)基上的保存時間卻非常短，20天后轉接的死亡率即將

54、近一半，從之后的2次轉接記錄我們可以看出，我們應該在10-15天內就對弧菌進行轉接，這期間死亡率低于10 % ，最好是在10天左右就轉接，死亡率可能會小于5 %</p><p>　　分離的42株弧菌中，由于死亡的弧菌較多，可能會影響到實驗結果，其中有5株弧菌的死亡導致無法測序，從而無法鑒定它們的系統(tǒng)發(fā)育地位，另外DNA提取失敗2株，未鑒定成功2株，這使得弧菌種屬多樣性的數(shù)據(jù)有些缺陷。這可能是導致健康塘和病害塘養(yǎng)殖

55、水體的弧菌多樣性差異不大的原因之一。另外，由于時間和資源的局限，該實驗分離純化的弧菌數(shù)量不多，這也有可能導致健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌種類多樣性的差異不太明顯。</p><p>　　總而言之，從該實驗的數(shù)據(jù)來看，健康塘和病害塘養(yǎng)殖水體的弧菌群落結構，它們本身的差異不大，不過病害塘的種類分布較健康塘的要集中，第一優(yōu)勢種群也較健康塘的不同。至于弧菌的培養(yǎng)特性和分析的弧菌數(shù)量是否對實驗結果產生了影響，就有待進一步的研

56、究表明了。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　從吳建平等的文章[24]中可知，大亞灣海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域弧菌的數(shù)量和種類呈明顯的季節(jié)性變化，弧菌數(shù)量從5月份開始逐漸增多，8月份達到最高值，11月份后又開始減少并趨于穩(wěn)定；弧菌的種類也有季節(jié)變化，比如溶藻弧菌較多出現(xiàn)在6-11月，尤其是8-10月，副溶血弧菌較多出現(xiàn)在5-9月。這可能與環(huán)境中可

57、利用的營養(yǎng)物質和理化因子有關，這些往往是影響細菌生長繁殖的因素，也可直接影響?zhàn)B殖動物的生長發(fā)育，不同的季節(jié)有不同的營養(yǎng)物質和理化因子的組成，不同的弧菌種類對其的適應性不同，結果導致不同季節(jié)，弧菌的數(shù)量和種類不同。由于采樣點和時間的限制，該實驗僅分析了7月份的健康養(yǎng)殖水體和病害養(yǎng)殖水體的弧菌群落結構比較，沒有進行連續(xù)的群落演替研究。其次，該實驗對采樣水體的營養(yǎng)物質和理化因子也未進行深入的分析，因此也未能分析其與弧菌群落變化的關系。在這兩方

58、面深入研究，能使弧菌的群落結構分析更完整更全面。另外，解決弧菌不易在TCBS培養(yǎng)基上長期存活的問題，增加實驗分析的弧菌數(shù)量等也能提高實驗數(shù)據(jù)的可靠性。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 陳萍, 李吉濤, 李健, 劉淇, 劉萍. 溶藻弧菌對三疣梭子蟹抗氧化酶系統(tǒng)的影響, 海洋科學. 2009, 33(5) : 59-63.<

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