1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　大彈涂魚、彈涂魚的線粒體COI基因差異及系統(tǒng)發(fā)育</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄<

3、;/b></p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法1</b></p><p>　　1.1 樣品采集1</p><p>　　1.2 基因組DNA提取1</p><p>　　1.3 PCR擴增及序列測定1</p&g

4、t;<p>　　1.4 基因序列信息的收集2</p><p>　　1.5 基因序列的分析2</p><p><b>　　2結(jié)果與分析2</b></p><p>　　2.1 大彈涂魚、彈涂魚COI基因序列特征及變異2</p><p>　　2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離4</p><

5、p>　　2.3 蝦虎魚科分類及其分子系統(tǒng)樹5</p><p><b>　　3討論6</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻7</b></p><p>　　摘要：本研究探討將蝦虎魚科魚類線粒體COI基因作為DNA條形碼在物種鑒定上應(yīng)用的可

6、行性。采集蝦虎魚科中的大彈涂魚(B.pectinirostris)和彈涂魚(P.cantonensis)各6尾，從其肌肉抽提DNA，然后PCR擴增線粒體COI基因，純化并測序。研究中獲得了這2種蝦虎魚科魚類長度約為650bp的COI基因序列。該序列與GenBank下載的其它12種蝦虎魚科魚類的COI基因序列，經(jīng)ClustalX輔助校正，采用MEGA軟件以Kimura-2-parameter計算出種間及種內(nèi)距離，并基于NJ和MP法構(gòu)建出1

7、4種蝦虎魚科魚類分子系統(tǒng)樹。大彈涂魚和彈涂魚種內(nèi)遺傳距離分別為0.002和0.008，而14種蝦虎魚科魚類種間平均遺傳距離為0.224。在分子系統(tǒng)樹上，14個種均可形成單系，其中背眼蝦虎魚亞科的大彈涂魚和青彈涂魚間的遺傳距離較大彈涂魚和彈涂魚的小，所以在系統(tǒng)發(fā)育上大彈涂魚屬與青彈涂魚屬間的親緣性比大彈涂魚屬與彈涂魚屬間的親緣性高。</p><p>　　關(guān)鍵詞：大彈涂魚；彈涂魚；COI基因；系統(tǒng)發(fā)育</p&g

8、t;<p>　　Abstract: In this study, we discussed the validation of COI gene sequence to efficiently identify the species of genus Gobiidae. B.pectinirostris and P.cantonensis of Gobiidae species were collected each s

9、ix one for this study, their genomic DNAs was extracted from muscle, and the mitochondial COI gene fragments were amplifies with PCR. After purification, the amplifie d products were sequenced. The experimental results s

10、howed that a gene fragment of this two species with molecular size about 65</p><p>　　Key words: Boleophthalmus pectinirostris; Periophthalmus cantonensis; Cytochrome oxidase subunit I (COI); Phylogenesis<

11、/p><p><b>　　引言</b></p><p>　　蝦虎魚科（Gobiidae）屬鱸魚目，蝦虎魚亞目。蝦虎魚科魚類的特點是身體細長，有兩條脊鰭，大多數(shù)蝦虎魚科魚類前鰭化為吸盤，可于岸邊爬行，如：彈涂魚，大彈涂魚。該科魚類分布于全世界，一共大約有800多種，它們大多棲息于熱帶的海水中，是一種體型較小的食肉魚類。</p><p>　　當前，已經(jīng)

12、有很多人研究過COI基因序列作為DNA barcode用于系統(tǒng)分類及物種鑒定上的的應(yīng)用(王中華等，2010；肖武漢等，2000；許守明等，2009)。雖然因為涉及線粒體的進化歷史、遺傳特性和物種成種時間的默認前提使得利用COI基因作為DNAbarcode并非完全成立，但是細胞色素C氧化酶1號基因（COI）的部分序列是目前在動物中最適用的DNA barcode（柏干榮等，2003；李鐵華等，2003；李連之等，2001）。且隨著標準數(shù)據(jù)庫

13、的建立，基于COI基因的DNA barcode在生物分類學和生態(tài)學中將得到廣泛應(yīng)用。近年來，在魚類、昆蟲、鳥類等動物的鑒別分類研究中COI作為掃描生命的條形碼已被廣泛用到。</p><p>　　現(xiàn)今，因為COI條碼序列獲取很便捷，廣泛適用硬骨魚類物種鑒別，并可用于低級分類階元的系統(tǒng)進化分析（劉楚吾等，2009；關(guān)申民等，2008），如：由青石斑魚COI與線紋刺尾鯛COI同源性很高，可判斷青石斑魚與線紋刺尾鯛親緣性

14、很高（施大衛(wèi)等，2009）；采自東海的銀鯧、翎鯧和中國鯧3種鯧屬魚類的線粒體COI基因序列片段進行研究，能從分子水平研究中國東海海域鯧屬魚類的分類、遺傳關(guān)系和系統(tǒng)進化，以其了解鯧屬魚類以及與鯧科之間的親緣關(guān)系，又為鯧屬魚類保護生物學和系統(tǒng)進化提供分子生物學依據(jù)（張鳳英等，2008）；Hebert等（2003b)對動物界11個門13320個物種的研究結(jié)果顯示，線粒體COI基因(細胞色素氧化酶亞基1)靠近5 端的一段序列能夠?qū)游锝绲奈锓N進

15、行有效的鑒定，并且在多數(shù)動物類群中，COI基因都存在顯著的序列變異。彭居俐等（2009）研究了基于線粒體COI基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌屬魚類物種鑒定中的應(yīng)用。目前，對動物界物種進行DNA條形碼研究所通常選擇的基因就是COI基因。因此，雖然現(xiàn)在對于用COI基因片段作為魚類分類鑒定的DNAbarcode研究還比較少，但魚類資源保護日益</p><p>　　本研究將通過對大彈涂魚、彈涂魚及另外12種蝦虎魚科魚類C

16、OI基因序列的分析研究，從而分析大彈涂魚與彈涂魚的系統(tǒng)進化關(guān)系，并總結(jié)出14種蝦虎魚科的基因序列的差異，進而為以后基于COI基因的DNAbarcode在魚類物種鑒定的研究奠定基礎(chǔ)，為魚類分類學及生態(tài)學的發(fā)展提供參考。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 樣品采集</b></p>&l

17、t;p>　　本研究使用的大彈涂魚、彈涂魚各6個個體，大彈涂魚采集自浙江省寧海縣，而彈涂魚采集自浙江省慈溪市杭州灣。從其各取背部肌肉組織樣品放入液氮中過夜后，于－80℃保存?zhèn)溆茫P(guān)飛等，2007；陳虹等，2003；Gasse R B et a1.,1999）。</p><p>　　1.2 基因組DNA提取</p><p>　　取樣品背部肌肉100mg加液氮研磨，加500μL裂解液、20

18、μL蛋白酶K、1μLRNA酶，在55℃水浴至完全溶解。加等體積飽和酚，輕輕混勻于4℃、12000rpm離心20min后，小心移取上清液于新的滅菌離心管中，再加入等體積（500μL）酚二氯仿二異戊醇（25:24:1），混勻于4℃，12000rpm離心15min，再移取等體積（500μL）氯仿二異戊醇（24:1）上下顛倒混勻后于12000rpm離心15min。移取上清液，取剩余液的1/10體積（50μL）加入3M的NaAC和2倍體積（100

19、0μL）預冷的無水乙醇(－20℃)于－20℃冰箱過夜。24h后，4℃，10000rpm離心15min，棄上清液，然后加入70％酒精1mL反復洗滌，沉淀再次離心15min。將沉淀于放置至無酒精味。最后用適量的溶液TE溶解，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.3 PCR擴增及序列測定</p><p>　　PCR擴增的目的片段是COI基因靠近5’端的長度為650左右的序列。其擴增和

20、測序引物參照文獻(Ward et al.,2005)，由上海生工合成，引物序列為：F1：TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATTGGC AC; F2：TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATCGGC AC;PCR反應(yīng)使用的每一樣品擴增體積為50μL，其中無菌水17.5μL，引物各2.5μL，TAE緩沖液25μL，DNA模板2.5μL。PCR反應(yīng)條件為：預變性94℃ 5min，變性94℃ 30s,退火54℃ 30

21、s，延伸72℃ 30s，最后延伸72℃ 10min，保溫4℃。擴增產(chǎn)物經(jīng)2％ 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將陽性PCR產(chǎn)物送至Invitrogen公司完成測序工作。</p><p>　　1.4 基因序列信息的收集</p><p>　　除本研究所檢測的2種蝦虎魚科魚類彈涂魚和大彈涂魚外，從 GenBank 下載12種蝦虎魚科魚類及烏塘鱧科的烏塘鱧（Bostrychus sinensis）的COI

22、基因序列。利用本研究的2種蝦虎魚科和這另外的12 種蝦虎魚科魚類的COI基因同源序列一起分析研究，將同為蝦虎魚亞目的烏塘鱧科烏塘鱧的COI基因同源序列用作外群（楊天燕等，2007；柳淑芳等，2010）。所分析物種的COI基因及其相關(guān)信息見表1。</p><p>　　1.5 基因序列的分析</p><p>　　獲得的測序結(jié)果先利用NCBI軟件中的Blast工具進行相似性的檢索，以確認實驗所得

23、基因序列是目的片段（張儀等，2004）。用ClustalX 軟件對本研究所得序列和GenBank 下載的相關(guān)序列進行排序并進行手工校正剪切，然后用MEGA軟件計算出序列的堿基組成、種內(nèi)以及種間遺傳距離。分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用的是鄰接法(NJ)和最大簡約法(MP)。鄰接法分析采用Kimura-2-parameter遺傳距離，進行1000 次自展分支檢驗。最大簡約法分析使用啟發(fā)式搜索，構(gòu)樹方法采用二等分再連接(Tree-bisection r

24、econ-nection, TBR)，所有數(shù)據(jù)均未加權(quán)，獲得50%一致性的樹，可靠性由1000 次自展分支檢驗（楊學明等，2006；柳淑芳等，2010；Murgia R et al.,2002）。</p><p>　　表1 本研究所分析物種的COI基因信息</p><p>　　Tab.1 Information of COI genes of analytical species in t

25、his study</p><p><b>　　*表示外群</b></p><p>　　*represent the outgroup</p><p><b>　　2結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1 大彈涂魚、彈涂魚COI基因序列特征及變異</p><p>　　

26、本研究所使用的引物位于COI 基因的5’端，采用上游引物F1與下游引物R1 對總DNA 進行PCR。通過PCR可獲得的2種蝦虎魚科背眼蝦虎魚亞科的魚類，即彈涂魚和大彈涂魚各6個個體的線粒體COI基因部分片段，片段長度約為650bp，表明COI基因通用引物在蝦虎魚科中具有一定的普遍適用性。</p><p>　　由圖1可見，本研究兩種蝦虎魚科魚類提取的基因組DNA及PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后都能較好的分離成像。</p&

27、gt;<p><b>　　A</b></p><p><b>　　B</b></p><p>　　圖1 提取的DNA電泳圖及PCR擴增結(jié)果</p><p>　　Fig.1 The electrophoresis figures of extracting DNA and PCR product</p&g

28、t;<p>　?。翞榛蚪MＤＮＡ電泳圖；Ｂ為ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖。彈涂魚個體編號為：1，2，3，4，5，6；大彈涂魚個體編號為：B1，B2，B3，B4，B5，B6。Ａ圖Marker為1Kb DNA Marker；Ｂ圖Mark 為PCU 19 DNA Marker。</p><p>　　A is the Genomic DNA electrophoresis figure; B is the PCR pr

29、oducts electrophoresis figure. The individual B.pectinirostris Numbers for: 1, 2, 3, 4, 5, 6; the individual B.pectinirostris Numbers for: B1, B2, B3, B4, B5, B6. A figure Marker for 1Kb DNA Marker; B figure Marker for P

30、CU 19 DNA Marker.</p><p>　　采用ClustalX軟件對本研究所得的兩種COI部分序列和12個已發(fā)表蝦虎魚科魚類COI同源序列進行聚類和排序，保留其共有序列，長度為601bp，編碼200個氨基酸。用MEGA4計算這24條序列的堿基組成，平均堿基組成為：A：23.8%、T：29.2%、G：18.6%、C：28.4%，A+T含量(53.0%) 高于G+C(47.0%)。而對所研究的14種魚2

31、4個COI基因片段來說，第1密碼子位點G+C 含量(57.1%)顯著高于第2和第3密碼子位點(44.0%和30.7%) (表2)。</p><p>　　所有個體序列核苷酸變異情況見表3。全部位點中不變位點有486個，轉(zhuǎn)換位點有67個，顛換位點有48個。其中不變位點屬第2碼子位點最多，為200個；而轉(zhuǎn)換位點和顛換位點均屬第3密碼子位點最多，分別為59個和47個。</p><p>　　由表 4

32、可以看出，這14種蝦虎魚科魚類24個個體的COI基因平均 GC含量為39.6%—50.4%，其中第1密碼子位點的GC含量均較高(45.7%—58.2%)，第2密碼子的GC含量高度一致都為44.0%，第3密碼子的GC含量變化范圍最大(27.5%—49.0%)。而大彈涂魚和彈涂魚COI基因片段的GC含量相對較低，分別為40.6%和39.6%。</p><p>　　表2 所選蝦虎魚科個體的COI基因部分序列中各堿基平均

33、分布頻率(%)</p><p>　　Tab.2 Average nucleotide frequencies of COI partial sequences of the selected Gobiidae species (%)</p><p>　　表3 所選蝦虎魚科個體的COI部分序列各密碼子堿基變異情況</p><p>　　Tab.3 Sequences v

34、ariation of COI gene of the selected Gobiidae species</p><p>　　表4 本研究所選蝦虎魚科個體的COI基因密碼子位點GC 含量</p><p>　　Tab.4 The GC content for all codon position of the selected Gobiidae species COI gene in th

35、is study</p><p>　　2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離</p><p>　　14 種蝦虎魚科魚類的種內(nèi)和種間遺傳距離,采用MEGA基于Kimura-2-parameter計算出來（柳淑芳等，2010）。結(jié)果，蝦虎魚科魚類種內(nèi)遺傳距離平均值為0.005種間遺傳距離平均值為0.224遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的44.8倍。彈涂魚和大彈涂魚的種內(nèi)遺傳距離分別為0.008和0.002，均未

36、超過Hebert 等(2003a)所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020。除此之外，其余12 種蝦虎科魚類的種內(nèi)遺傳距離因只有一個樣品而未算出，以n/c表示(表5)。14 種蝦虎魚科魚類中種間平均遺傳距離全部大于0.020，其中84.6%以上的種間平均遺傳距離大于0.200。遺傳距離最大的是蝦虎魚亞科絲蝦虎魚屬的絲蝦虎魚和同一亞科葉蝦虎魚屬的五線葉蝦虎魚，為0.292。遺傳距離最小的是背眼蝦虎魚亞科大彈涂魚屬的大彈涂魚和同一亞科青彈

37、涂魚屬的青彈涂魚，為0.148，大彈涂魚與彈涂魚的遺傳距離次之，為0.163。依據(jù)Hebert 等(2003a, b)的說法，說明這三種蝦虎魚科魚類在遺傳上有較大親緣性。</p><p>　　表5 所選魚類兩兩比對的種間平均遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離</p><p>　　Tab.5 Genetic distance within-species and pairwise-species in

38、the selected species</p><p>　　2.3 蝦虎魚科分類及其分子系統(tǒng)樹</p><p>　　采用MEGA基于MP和NJ 法，對蝦虎魚科三個亞科14種魚類的24個COI基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，得到的結(jié)果具有相似的拓撲結(jié)構(gòu)，但節(jié)點支持率相對較低，結(jié)果如圖2。從圖2 可見，大彈涂魚和彈涂魚的不同個體均可聚在同一分支內(nèi)，且14個種均可形成單系。NJ樹和MP樹具有較高的相似

39、性，且兩系統(tǒng)樹都顯示大彈涂魚與青彈涂魚分入同一分支，而彈涂魚位于另一分支。</p><p>　　在NJ和MP分子系統(tǒng)樹上， 還表現(xiàn)出一些與中國動物志分類法不一致的結(jié)果。Gobionellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis這四種魚類按照國際分類法，應(yīng)被分入蝦虎魚科中的一個新的亞科——擬蝦虎魚亞

40、科，而中國動物志則把它們歸入蝦虎魚亞科中。從本研究的分子系統(tǒng)樹上看，這四種魚類與蝦虎魚亞科的魚類已經(jīng)達到了亞科上的差異，也與背眼蝦虎魚亞科魚類的在分子系統(tǒng)樹上達到并列的位置，因而本研究結(jié)果在一定程度上支持國際分類法。</p><p><b>　　NJ樹</b></p><p><b>　　MP樹</b></p><p>　

41、　圖2 MP和NJ 法構(gòu)建的14種蝦虎魚科魚類分子系統(tǒng)樹</p><p>　　Fig.2 MP and NJ tree resulting from 14 Gobiidae species</p><p><b>　　3討論</b></p><p>　　本研究的兩種蝦虎魚科魚類大彈涂魚和彈涂魚采樣點分別為浙江寧海和浙江慈溪，且這兩種魚類的種內(nèi)

42、距離分別為0.002和0.008，種間距離為0.163，遠遠大于Hebert 等(2003a)推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離為0.020，說明本研究中的兩種蝦虎魚科魚類采樣正確。</p><p>　　研究中的14 種蝦虎魚科魚類24個個體的COI基因GC含量為39.6%—50.4%，平均為45.3%；其中第1 密碼子位點的GC平均含量達52.1%，貢獻最大；第3 密碼子的GC 含量變化范圍最大 (27.5%—49

43、.0%)；第2密碼子的GC 含量高度一致均為44.0%。而Ward 等(2005)分析了澳大利亞207 種魚類的COI基因序列, 結(jié)果表明143 種硬骨魚類的GC 平均含量為47.1%，高于61 種軟骨魚類42.2%的GC 平均含量。其中第1、2、3 密碼子的GC 平均含量分別為57.1%、42.6%、41.1%，然而研究中的大彈涂魚、彈涂魚及青彈涂魚的GC含量各為40.6%，39.6%，43.2%，三種平均GC含量41.1%，低于報道

44、中的軟骨魚類42.2%。這種造成蝦虎魚科背眼蝦虎魚亞科的魚類GC平均含量低于軟骨魚類的現(xiàn)象還有待進一步研究。另外，柳淑芳（2010）研究的石首魚科30 種石首魚科魚類的75 個COI基因序列GC 含量平均為48.3%，其中第2 密碼子位點GC 含量平均為56.6%，第1 密碼子的GC 平均含量為44.9%，第3 密碼子的GC 平均含量為42.</p><p>　　除此之外，較大的種間序列差異是對物種進行準確鑒定的

45、先決條件(彭居俐等，2009)。Hebert 等(2003a)對動物界的11個動物門13320個物種進行分析得出物種內(nèi)的遺傳距離很少有大于0.020 的，大部分的種內(nèi)遺傳距離小于0.010。Hebert 等(2003a，b)提出，利用COI基因序列有效鑒別物種的關(guān)鍵點是種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離，并且距離差異大約10 倍。本研究的14種蝦虎魚科魚類的種內(nèi)遺傳距離平均值為0.005，種間遺傳距離平均值為0.224，種間遺傳距離是

46、種內(nèi)遺傳距離的45.8倍。因此，可以說明COI基因序列能夠?qū)ξr虎魚科魚類進行有效的物種鑒定，可將蝦虎魚科的線粒體COI基因序列做成DNA條形碼（柳淑芳等，2010；譚曉玲等，2002）。</p><p>　　從分子系統(tǒng)樹中可看出，本研究的彈涂魚和大彈涂魚的各6個不同個體都能夠聚集在各自的同一分支內(nèi), 且14個種均可形成單系。更重要的是，本研究的三大亞科蝦虎魚亞科葉蝦虎魚屬的寬紋葉蝦虎魚、黃體葉蝦虎魚、五線葉蝦虎魚

47、，凡塘鱧屬的六斑凡塘鱧、絲條凡塘鱧、雙帶凡塘鱧，及絲蝦虎魚屬的絲蝦虎魚；背眼蝦虎魚亞科的彈涂魚、大彈涂魚、青彈涂魚；擬蝦虎魚亞科的Gobionellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis。在MP和NJ系統(tǒng)樹中這三個亞科的魚類都能夠分入各自的分支中，并能夠清楚地觀察出蝦虎魚科這三個亞科的魚類。說明目前國際分類法將Gobi

48、onellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis分入一個新的亞科擬蝦虎魚亞科中，是比較合理的。另一方面，本研究的分子系統(tǒng)樹也充分證明了蝦虎魚科魚類在分子上分類和形態(tài)學上的分類基本一致（陳崢宏等，2009；董云偉等，2002）。</p><p>　　NJ和MP系統(tǒng)樹上，均可看出大彈涂魚和彈涂魚的遺

49、傳距離比大彈涂魚和青彈涂魚的大。表五中的大彈涂魚和彈涂魚的種間遺傳距離為0.163，而大彈涂魚和青彈涂魚的種間遺傳距離為0.148，前者種間的遺傳距離也大于后者。因此，本研究可證明大彈涂魚和青彈涂魚在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系較大彈涂魚和彈涂魚的關(guān)系較為密切。</p><p>　　綜上所述，基于蝦虎魚科魚類的線粒體COI基因構(gòu)建出的分類系統(tǒng)與形態(tài)學的分類單元劃分基本一致，所以可以根據(jù)該基因的差異來探討蝦虎魚科屬、種分類單元

50、的系統(tǒng)發(fā)育問題。但兩系統(tǒng)樹的節(jié)點值都比較低，可能蝦虎魚科魚類COI基因較為保守，這還需要大量的研究證明。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 柏干榮, 陸松敏. 線粒體DNA編碼細胞色素氧化酶亞基基因突變與疾病[J]. 國外醫(yī)學:分子生物學分冊,2003, 23(4):393-395. </p><p>

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