1、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），又稱日本腦炎病毒。屬于黃病毒科（Flaviviridae）、黃病毒屬，日本腦炎病毒廣泛分布于亞洲南部和東南地區(qū)，其中包括中國、印度、日本等地。主要通過蚊子傳播致使人發(fā)生急性腦炎，其致死率從20％到50％，并且絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥。豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關(guān)。因此，預(yù)防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。穩(wěn)定、安全以及新型

2、的乙腦疫苗已經(jīng)成為近年乙腦感染防治的主要研究方向。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，乙型腦炎基因工程疫苗等多種新型的疫苗都在不斷的研究開發(fā)中。疫苗在保護(hù)機(jī)體免受病毒感染中起到重要作用，Prime-boost（DNA初免和蛋白加強(qiáng)）免疫的方法是通過DNA編碼病毒目的蛋白進(jìn)行首次免疫，再用此體外表達(dá)的蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫的策略。通過DNA初免和蛋白加強(qiáng)免疫的策略，我們對(duì)日本腦炎病毒NS1蛋白的效力進(jìn)行了研究。本研究主要從以下幾個(gè)方面展開。<

3、br>　　 1.合成日本腦炎病毒NS1蛋白，在此基礎(chǔ)上將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.0中，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pcDNA-NS1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，利用間接免疫熒光證明pcDNA-NS1在真核細(xì)胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；Western-blot檢測(cè)表明重組真核質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物能與JEV陽性血清特異性結(jié)合，證明其具有一定的生物學(xué)活性和抗原性。
　　 2.擴(kuò)增NS1基因片段，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a（+），命名

4、為pET-rNS1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定的陽性菌經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，將大腸桿菌以6000 rpm離心10min，用PBS洗兩次，收集細(xì)菌，將其懸浮在PBS中，進(jìn)行超聲波破碎，以10000 rpm離心20min，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明這種蛋白以包涵體形式存在.將包涵體在8M的尿素中過夜溶解，然后將上清過柱對(duì)重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。結(jié)果顯示融合

5、蛋白的分子量為40kDa，Western blot表明重組蛋白具有抗JEV的特異抗原性。
　　 3.利用新型的免疫策略，為了評(píng)價(jià)構(gòu)建的DNA疫苗和重組蛋白疫苗的免疫效力，將4周齡Ba1b/c小鼠隨機(jī)分成5組，設(shè)rNS1（Ⅰ），pcDNA-NS1（Ⅱ），pcDNA-NS1+rNS1（Ⅲ），弱毒疫苗（Ⅳ），pcDNA3.0空載體對(duì)照組（Ⅴ）。肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為50μg/只，重組蛋白的免疫劑量為200 pmol/只，弱

6、毒苗免疫組按照使用說明進(jìn)行。利用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4的能力，并與弱毒苗進(jìn)行比較。同時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，利用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)免疫攻毒后的中和抗體。結(jié)果表明，新型的疫苗策略能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)JEV的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。弱毒苗免疫組產(chǎn)生了最高的中和抗體，其次由高到低依次為，pcDNA-NS1+rNS1，rNS1，pcDNA-NS1。通過對(duì)抗體亞型及細(xì)胞因子的測(cè)定，rNS1主要是增強(qiáng)T