1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　滸苔多糖磷酸化條件的優(yōu)化</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p&g

2、t;　　滸苔多糖有降血脂、抗脂質(zhì)氧化作用、提高SOD酶活力、消炎、抑制皮膚癌以及對非特異性免疫功能的作用等生理功能。但是滸苔多糖的活性直接或間接地受到其結(jié)構(gòu)的制約。分子修飾可通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置而對其理化性質(zhì)、生物活性、功能特性產(chǎn)生影響。通過對其多糖分子進(jìn)行磷酸化可提高其生物活性、降低毒性并可以擴(kuò)大滸苔多糖在食品中的應(yīng)用。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題

3、：</p><p>　　在滸苔中進(jìn)行滸苔粗多糖的提取與分離，并用磷酸化試劑進(jìn)行磷酸化修飾，在溫度、pH值、反應(yīng)時間、添加量等4因素水平上設(shè)計正交試驗，測定修飾后的多糖的抗氧化活性優(yōu)化磷酸化工藝條件。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　熱水浸提法 磷酸化試劑抗氧化活性</p><p>　　四、研

4、究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010/10—2010/11 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行外文翻譯，了解基本操作規(guī)程。</p><p>　　2010/11—2010/12 查閱資料，編寫開題報告.開題答辯。</p><p>　　2011/2—2011/5 滸苔多糖磷酸化條件優(yōu)化研究實驗進(jìn)行。</p><p>　　2011/5

5、—2011/6 數(shù)據(jù)處理、分析，得出結(jié)論。撰寫畢業(yè)論文。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 張難,吳遠(yuǎn)跟,莫莉萍等.磷酸化香菇多糖制備工藝的研究[J].食品科技,2008,2:81-85</p><p>　　[2] 李燦鵬，陳德義，趙逸云等. 食品蛋白質(zhì)磷酸化改性的研究進(jìn)展[J].食品科

6、學(xué),2009,11(30):252-255</p><p>　　[3] 袁懷波,劉國慶,陳宗道.磷酸化改性玉米蛋白的性質(zhì)[J].食品科學(xué),2007,10(28):50-52</p><p>　　[4] 張智芳,林文庭,陳燦坤.滸苔水溶性多糖提取工藝研究[J].中國食物與 營養(yǎng),2009,

7、3:39-41</p><p>　　[5] 周蕙萍,朱海燕,陳瓊?cè)A.滸苔多糖的分離、純化和分析[J].生物化學(xué)雜志,1995,11(1):91-93</p><p>　　[6] 林文庭,張智芳.滸苔多糖降血脂及抗脂質(zhì)過氧化作用[J].中國公共衛(wèi)生,2009,25(5):567-570</p><p>　　[7] 徐大倫,黃曉春,歐昌榮等.滸苔多糖對扇貝SOD和溶菌酶

8、活力的影響[J].水利漁業(yè),2005,25(3):22-23</p><p>　　[8] 陳立貴,袁新強,王忠等. 三偏磷酸三鈉對魔芋葡甘聚糖的改性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(5):1767-1769</p><p>　　[9] 高夢祥,葉森.海帶多糖的提取工藝研究[J].長江大學(xué)學(xué)報,2005,2(5):76-79</p><p>　　[10] 周家

9、春,張達(dá)力, 曾瀚權(quán). 淀粉磷酸化及其抗冷凍脫水的研究[J].廣州食品工業(yè)科技,1999,16(1):43-45</p><p>　　[11] 康鵬,張坤生,任云霞. 酪蛋白磷酸化工藝技術(shù)的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(9):21-24</p><p>　　[12] 李志軍. 多糖脫蛋白質(zhì)方法的比較[J].農(nóng)家之友,2009,2:24-25</p><p

10、>　　[13] 陽佛送,李雪華. 多糖結(jié)構(gòu)研究的方法和進(jìn)展[J].食品安全與檢測,2008,3:201-203</p><p>　　[14] 高續(xù)春,多糖提取純化方法研究進(jìn)展[J]. 榆林學(xué)院報,2009,19(4):65-67</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程&l

11、t;/b></p><p><b>　　磷酸化滸苔多糖概述</b></p><p>　　摘要 滸苔多糖作為一種生物活性大分子，具有提高SOD酶活力、抗脂質(zhì)氧化、降血壓等功效。但受其分子結(jié)構(gòu)的的影響大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，通過對多糖的分子修飾從而改變其分子結(jié)構(gòu)提高它的應(yīng)用范圍。對滸苔多糖的磷酸化，是采用磷酸試劑并通過設(shè)計單因素4水平的正交因素表格來優(yōu)化其實

12、驗條件</p><p>　　關(guān)鍵詞 滸苔多糖;分子修飾;磷酸化</p><p><b>　　1.滸苔多糖</b></p><p>　　多糖作為生命活動四大基本物質(zhì)之一,在生命活動中發(fā)揮著重要作用。多糖不僅參與細(xì)胞識別、分子識別、生物體受精生長發(fā)育以及免疫過程,而且還發(fā)現(xiàn)了其與炎癥、自身免疫、腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等生理、病理過程密切相關(guān)[1].滸苔

13、(Entermorpha)為綠藻門(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaleae)藻類,在我國野生藻類中屬資源豐富的品種,尤其是在浙江沿海有優(yōu)勢種[2]。滸苔營養(yǎng)豐富,含有多種人體必需的氨基酸、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì),其中鐵含量為我國食物之最。滸苔自古以來就是我國沿海居民食、藥用藻類,有清熱解毒、消炎之效。據(jù)《本草綱目》記載:滸苔可“燒末吹鼻止衄血,湯浸搗敷手背腫痛”。此外,它還有軟堅散結(jié)、降低膽固醇的功

14、效,可用于預(yù)防和治療甲狀腺腫。據(jù)報道,滸苔多糖有降血脂、抗脂質(zhì)氧化作用[3]、提高SOD酶活力[4]、消炎、抑制皮膚癌以及對非特異性免疫功能的作用[5]等生理功能。</p><p>　　1.1滸苔粗多糖提取</p><p>　　多糖的提取方法很多，主要有熱水浸提法、酶法提取、超聲法提取、超臨界萃取法等[6].但由于熱水浸提法工藝簡單，操作方便，得率較高等優(yōu)點，目前國內(nèi)提取多糖大多采用熱水浸

15、提法，如高夢祥[7]等對海帶多糖的提取中運用了此方法，徐大倫等[8]用熱水浸提法通過單因素實驗確定其最佳提取工藝條件為浸提時間4h,溫度90,固液比為1:75.此外張智芳等[9]也用熱水浸提法對滸苔多糖進(jìn)行工藝優(yōu)化，設(shè)計了單因素四水平的正交實驗研究PH、溫度、浸提時間和固液比對多糖得率的影響。</p><p><b>　　1.2 多糖的分離</b></p><p>　

16、　活性多糖的分離純化是指獲得粗的活性多糖后,除去共存雜質(zhì),得到純度較高多糖產(chǎn)品.根據(jù)高續(xù)春多糖研究進(jìn)展[6]中提到的多糖純化的方法有很多包括透析法、分級沉淀法、凝膠柱層析法、纖維素柱層析法、離子交換樹脂法等。</p><p>　　1.2.1 脫蛋白質(zhì)</p><p>　　多糖與蛋白質(zhì)兩種高分子成分共存，且兩種物質(zhì)分子量相近，另外多糖常常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物，脫蛋白質(zhì)成為多糖純化的一個重要

17、步驟.主要用到的是seveage法，三氯乙酸法、酶法等[10].此外發(fā)現(xiàn)還有酶法與seveage法聯(lián)用，如劉成梅等在百合多糖脫蛋白方法的研究[10]中對幾種方法的比較見表1</p><p>　　從表中知酶法與seveage法相對于其他方法來說得率較高。郭玉東等在苦瓜多糖脫蛋白方法的比較研究[12]中也論證了此結(jié)論的正確性.此外姚文華在大棗多糖的脫蛋白研究[13]中則通過對幾種酶的比較對酶工藝進(jìn)行優(yōu)化。</p

18、><p><b>　　1.2.2 去色素</b></p><p>　　此外滸苔多糖中還含有大量的色素，色素的取出常采用吸附法（纖維素、硅藻土、高嶺土、活性炭等）、離子交換法[14]、金屬絡(luò)合物法等。</p><p><b>　　1.4提取流程</b></p><p>　　滸苔干品—粉碎過篩—熱水浸提—抽

19、濾—超濾—酶法脫蛋白—雙氧水脫色—抽慮—濃縮—4倍體積95%乙醇沉淀—真空冷凍干燥—滸苔粗多糖[15]</p><p>　　2.天然生物分子磷酸化</p><p>　　2.1 天然多糖的分子修飾</p><p>　　分子修飾是通過化學(xué)、物理學(xué)及生物學(xué)等手段對化合物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得眾多結(jié)構(gòu)類型衍生物的方法。已完成的研究證實[16],多糖的活性直接或間接地受到其

20、結(jié)構(gòu)的制約。分子修飾可通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置而對其理化性質(zhì)、生物活性、功能特性產(chǎn)生影響。由此可分析多糖構(gòu)效關(guān)系，并為多糖類藥物及其他多糖產(chǎn)品的設(shè)計提供理論依據(jù)。選擇合適的方法對多糖進(jìn)行分子修飾，可改善其功能特性，提高其生物活性或降低其毒副作用。因此，對多糖進(jìn)行分子修飾已成為多糖構(gòu)效關(guān)系研究的重要手段，也是開發(fā)多糖產(chǎn)品的重要途徑[17]。</p><p>　　2.1.1常見的多糖修飾

21、方法及實例分析</p><p>　　分子修飾可通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置而對其活性產(chǎn)生影響。將多糖或寡糖進(jìn)行衍生化,如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等,有可能大大提高多糖的生物活性。其它修飾方法,如磷酸酯化、硬脂?；?、棕櫚?；?、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羧乙基化、碘化、氨化等[18].如對靈芝多糖進(jìn)行硒化研究中將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒不僅提高了吸收硒的能力[19]而且李慶偉等在小鼠

22、試驗中發(fā)現(xiàn)靈芝硒多糖可明顯增加小鼠血漿和肝GSH-Px、SOD的活性,降低小鼠血漿和肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量,其作用效果明顯強于靈芝多糖[20]。</p><p>　　2.2 食品中磷酸化的研究進(jìn)展</p><p>　　與其它化學(xué)修飾一樣,多糖的磷酸化分子修飾是一種共價修飾。多糖經(jīng)過磷酸化分子修飾后,支鏈上的羥基被磷酸根取代,從而增強多糖抗腫瘤和抗凝血的生物活性[21].食品中對蛋白分子磷酸

23、化修飾以及對玉米淀粉的磷酸化修飾較多。</p><p>　　2.2.1 蛋白質(zhì)磷酸化</p><p>　　食品蛋白通過磷酸化引入了大量帶有負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，在溶液中更易分散，從而增加其溶解度；降低了乳化液的表面張力，增加乳化性和乳化穩(wěn)定性；改變了等電點，有效地拓寬了其在食品的應(yīng)用范圍。國內(nèi)外的研究結(jié)果也表明磷酸化后的蛋白質(zhì)在表面疏水性、乳化性、熱穩(wěn)定性、起泡

24、性、凝膠形成性等性質(zhì)都有明顯改善，另外，磷酸基的導(dǎo)入能增加磷酸鈣的可溶能力，有利于鈣的吸收；研究結(jié)果還表明酪蛋白磷酸肽還能起到免疫調(diào)節(jié)和抗脂肪氧化的作用[22].</p><p>　　李燦鵬[22]等在蛋白質(zhì)磷酸化中對幾種磷酸化方法做出了比較見表2</p><p>　　表2 各種磷酸化方法的比較</p><p>　　Table 2 Characteristics o

25、f various phosphorylation on methods</p><p>　　除此之外1994年Taillar等[23]發(fā)表了在磷酸鹽存在時，在干燥加熱的條件下，具有具有羥基的糖、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖蛋白能被磷酸化，其反應(yīng)為：</p><p>　?。璒H+H3PO4→O－H2PO3+H2O</p><p>　　根據(jù)Taillar的方法除了對蛋白質(zhì)的研究

26、有利外，還可以找到多糖磷酸替代的羥基的工藝條件.而磷酸化蛋白的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)普遍，無論是在大豆分離蛋白、玉米蛋白[24]還是在花生[25]等植物蛋白豐富的天然大分子上.尤其是在酪蛋白磷酸化[26]上的應(yīng)用，對于擴(kuò)大酪蛋白這一重要蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用有著極為重要的作用</p><p>　　2.2.2植物體內(nèi)淀粉的磷酸化</p><p>　　植物中的淀粉磷酸酯化,使其在黏度、滲透性、凝膠性和吸

27、水性等理化性能上有顯著的特點。工業(yè)上所需的磷酸酯淀粉都是經(jīng)過物理或化學(xué)等方法加工而成的變性淀粉,其成本高,加工過程產(chǎn)生的污水對環(huán)境的污染較大。因此,通過基因工程等生物技術(shù)手段,加強植物體內(nèi)的淀粉磷酸化作用,直接合成淀粉磷酸酯,將會給變性淀粉行業(yè)帶來革命性的轉(zhuǎn)變[27]。謝淑蓉等闡述了淀粉磷酸化的機制，主要是利用一種叫做α-葡聚糖水合二激酶(α-glucan water dikinase,GWD)的酶下發(fā)生反應(yīng)：</p>&

28、lt;p>　　葡聚糖+ATP+水———葡聚糖-Pβ+AMP+Pγi </p><p>　　而完成淀粉的磷酸化. 周家春[28]等則以淀粉冷凍狀態(tài)下的持水能力為主要指標(biāo),研究了可用于冷凍食品的淀粉磷酸醋的最適合成條件。從磷酸鹽添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、PH值等方面初步研究了淀粉磷酸化制備的工藝條件。</p><p>　　2.2.3 多糖的磷酸化</p><p>

29、;　　Dana[29]等研究了纖維素多糖的磷酸化研究。對多糖的磷酸化這方面國內(nèi)進(jìn)行的研究較少，張難等采用混合磷酸鹽試劑（三偏磷酸鈉和三聚磷酸鈉）對香菇多糖進(jìn)行磷酸化修飾,并對其工藝條件進(jìn)行了初步的探索研究，以修飾后香菇多糖的磷酸根接枝量、黏度為考察指標(biāo),通過單因素和正交實驗,考察磷酸化試劑、溫度、時間、pH值對修飾后香菇多糖磷酸根接枝量、黏度的影響。結(jié)果確定最佳磷酸化工藝條件為:8%混合磷酸化試劑、溫度80℃、時間5 h、pH值8.0,

30、所得磷酸化香菇多糖衍生物的磷酸根接枝量為7.77%,黏度測定表明香菇多糖經(jīng)磷酸化后黏度幾乎沒有變化30，31]。</p><p>　　主要的工藝流程是： 香菇多糖—水浴（50度）—除雜—磷酸化反應(yīng)（加入一定量的磷酸化實際，主要是三篇磷酸鈉和三聚磷酸鈉，調(diào)節(jié)PH、溫度、反應(yīng)時間等）—3倍乙醇沉淀24h—冷凍干燥—香菇多糖磷酸化衍生物—鉬藍(lán)比色法測磷酸跟含量。</p><p>　　并對修飾后的

31、香菇多糖進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)以及對紅外光譜的分析得出修飾后的香菇多糖未受損傷且活性增加[32]。</p><p>　　2.2.4 滸苔多糖的磷酸化</p><p>　　國內(nèi)外對滸苔多糖的磷酸化這方面研究較少，根據(jù)前面提到的蛋白磷酸化、玉米磷酸化以及香菇多糖的磷酸化可以按照常規(guī)的化學(xué)方法（添加三偏磷酸酸鈉和三聚磷酸鈉）、酶磷酸化法等（陳世瓊[33]等）.然后設(shè)計單因素四水平（反應(yīng)溫度、反應(yīng)

32、時間、PH值、磷酸試劑濃度）的正交實驗，根據(jù)方差分析等數(shù)據(jù)處理得出最優(yōu)工藝條件，完成滸苔多糖的磷酸化，對保健品及功能性食品的開發(fā)有重要意義。</p><p><b>　　3 總結(jié)與展望</b></p><p>　　滸苔多糖作為一種生物活性分子多糖，具有降血壓、增強免疫力等功能.而且滸苔作為一種豐富的海洋資源，原料來源廣泛，開發(fā)前景廣闊，可用于保健品市場，亦可作為功能性

33、食品添加物。但由于多糖分子的各個方面的性質(zhì)大大縮小了其應(yīng)用范圍，磷酸化通過改變多糖的水溶性等因素同時還可增加其活性，因而大大增加了滸苔多糖在食品中的應(yīng)用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陽佛送,李雪華. 多糖結(jié)構(gòu)研究的方法和進(jìn)展[J].食品安全與檢測,2008,3:201-203</p><p>　　

34、[2] 徐大倫,黃曉春,歐昌榮等.滸苔多糖的分離純化及其對非特異性免疫功能的體外實驗研究[J]. 中國食品學(xué)報,2006,6(5):17-20</p><p>　　[3] 林文庭,張智芳.滸苔多糖降血脂及抗脂質(zhì)過氧化作用[J].中國公共衛(wèi)生生,2009,25(5):567-570</p><p>　　[4] 徐大倫,黃曉春,歐昌榮等.滸苔多糖對扇貝SOD和溶菌酶活力的影響[J].水利漁業(yè),

35、2005,25(3):22-23</p><p>　　[5] 徐大倫,黃曉春,楊文鴿等. 滸苔多糖的分離純化及其對非特異性免疫功能的體外實驗研究[J].食品科學(xué),2005,25(6):232-235</p><p>　　[6] 高續(xù)春.多糖提取純化方法研究進(jìn)展[J]. 榆林學(xué)院報,2009,19(4):65-67</p><p>　　[7] 徐大倫,黃曉春,歐昌榮等

36、.滸苔水溶性多糖提取的工藝研究[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報)自然科學(xué)版,2005,24(1):66-68</p><p>　　[8] 高夢祥,葉森.海帶多糖的提取工藝研究[J].長江大學(xué)學(xué)報,2005,2(5):76-79</p><p>　　[9] 張智芳,林文庭,陳燦坤.滸苔水溶性多糖提取工藝研究[J].中國食物與

37、 </p><p>　　營養(yǎng),2009,3:39-41</p><p>　　[10] 李志軍. 多糖脫蛋白質(zhì)方法的比較[J].農(nóng)家之友,2009,2:24-25</p><p>　　[11] 劉成梅,萬茵,涂宗財.百合多糖脫蛋白方法的研究[J].食品科學(xué),2002,23(1):89-90</p><p>　

38、　[12] 郭育東,單斌,李敏儀. 苦瓜多糖脫蛋白方法的比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(7):3225-3227</p><p>　　[13] 姚文華.大棗多糖脫蛋白的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2009,35(5):49-51</p><p>　　[14] 陳輝,李永輝,姚曲峋.離子交換技術(shù)在多糖分離純化中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,12(7):168-169

39、,172</p><p>　　[15] 徐大倫,歐昌榮,黃曉春. 滸苔多糖脫蛋白方法的研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(5):26-27</p><p>　　[16] 王兆梅,李琳,郭祀遠(yuǎn)等. 多糖結(jié)構(gòu)修飾研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2002,33(12):616-618</p><p>　　[17] 趙曉燕,王長云.分子修飾在多糖構(gòu)效關(guān)系究中的應(yīng)用[J]

40、.海洋湖沼通報,2003(3):10-13.</p><p>　　[18] 賴萍,林躍鑫. 天然多糖分子修飾研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2003,23(3):183-185</p><p>　　[19] 和朝軍,李景原,秦廣雍. 靈芝硒多糖的研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,3:9-11</p><p>　　[20] 李慶偉,尚德靜,崔喬,等.靈芝硒多糖Se

41、 GL P-1抗氧化與抗腫瘤作用的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報,2002,24(3):249-251.</p><p>　　[21] 張難,吳遠(yuǎn)根,周劍麗,等. 多糖的分子修飾及其在功能性食品中的應(yīng)用展望[J].食品研究與開發(fā),2007,28(8):159-161</p><p>　　[22] 李燦鵬,陳德義,趙逸云,等. 食品蛋白質(zhì)磷酸化改性的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30(11):2

42、52-255</p><p>　　[23] TARELLI E,WHEELER S F.Drying from phosphate-buffered solu-tions can result in the phosphorylation of primary and secondary alcoholgroups of saccharides,hydroxlyated amino acids,proteins,

43、andglycoproteins[J].Anal Biochem,1994,222:196-201.</p><p>　　[24] 袁懷波,劉國慶,陳宗道. 磷酸化改性玉米蛋白的性質(zhì)[J]. 食品科學(xué),2007,28(10):51-53</p><p>　　[25] 沈?qū)?楊光,孫亦鳴. 花生蛋白磷酸化改性的研究[J]. 中國食品添加劑,2007,5:96-98,101</p>

44、<p>　　[26] 康鵬,張坤生,任云霞. 酪蛋白磷酸化工藝技術(shù)的研究[J]. 食品研究與開發(fā)發(fā),2007,28(9):21-24</p><p>　　[27] 謝淑蓉,浦躍武,張本山. 植物體內(nèi)的淀粉磷酸化[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工,2006(5):57-59</p><p>　　[28] 周家春,張達(dá)力, 曾瀚權(quán). 淀粉磷酸化及其抗冷凍脫水的研究[J].廣州食品工業(yè)科技,19

45、99,16(1):43-45</p><p>　　[29] Dana Mihaela Suflet,Gabrielle Charlotte Chitanu,Valentin I.Popa. Phosphorylation of polysaccharides:New resultson synthesis and characterisation of phosphorylated cellulose[J].Sc

46、ience Direct,2006(66):1240-1249</p><p>　　[30] 張難,吳遠(yuǎn)跟,莫莉萍等.磷酸化香菇多糖制備工藝的研究[J].食品科技,2008,2:81-85</p><p>　　[31] 張難,邱樹毅,莫莉萍等.磷酸化香菇多糖的工藝優(yōu)化[J].工藝技術(shù),2008,29(5):187</p><p>　　[32] 張難,邱樹毅,吳遠(yuǎn)跟等

47、. 磷酸化香菇多糖的制備及其部分理化性質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(8):21-24</p><p>　　[33] 陳世瓊. 一種高溫細(xì)菌葡聚糖磷酸化酶的性質(zhì)研究(Ⅰ)[J].China Brewing,2009,4:74-76</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_

48、_屆）</b></p><p>　　滸苔多糖磷酸化工藝條件的優(yōu)化</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1引言13</b></p><p><b>　　2材料與方法14</b></p><p><b&

49、gt;　　2.1 材料14</b></p><p>　　2.1.1 原料14</p><p>　　2.1.2 試劑14</p><p><b>　　2.2 儀器15</b></p><p>　　2.3 實驗方法15</p><p>　　2.3.1 粗多糖的提取與制備15&l

50、t;/p><p>　　2.3.2磷酸化反應(yīng)16</p><p>　　2.3.3 樣品磷酸根的測定16</p><p>　　2.3.4磷酸化試劑對滸苔粗多糖磷酸化的影響17</p><p>　　2.3.5單因素實驗工藝優(yōu)化17</p><p>　　2.3.5.1反應(yīng)溫度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響17</p&

51、gt;<p>　　2.3.5.2反應(yīng)時間對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響17</p><p>　　2.3.5.3 反應(yīng)pH對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響17</p><p>　　2.3.5.4 磷酸化試劑濃度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響18</p><p>　　2.3.6滸苔粗多糖磷酸化正交試驗工藝優(yōu)化18</p><p>　

52、　3 結(jié)果與討論18</p><p>　　3.1 粗多糖的提取18</p><p>　　3.2 樣品磷酸根測定19</p><p>　　3.3磷酸化試劑對滸苔粗多糖磷酸化的影響20</p><p>　　3.4單因素實驗工藝優(yōu)化21</p><p>　　3.4.1 反應(yīng)溫度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響21&l

53、t;/p><p>　　3.4.2 反應(yīng)時間對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響22</p><p>　　3.4.3 反應(yīng)pH對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響22</p><p>　　3.4.4 磷酸化試劑濃度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響23</p><p>　　3.4.5 單因素實驗結(jié)論23</p><p>　　3.5 滸苔多

54、糖磷酸化正交試驗工藝優(yōu)化24</p><p>　　3.5.1 實驗結(jié)果及分析24</p><p>　　3.5.2 驗證試驗24</p><p><b>　　4 結(jié)論25</b></p><p><b>　　5展望25</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書

55、簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)25</b></p><p>　　附錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附錄1 文獻(xiàn)綜述錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附錄2 中英文翻譯錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要 本文研究了磷酸化滸苔多糖，采用混合磷酸鹽（三聚磷酸

56、鈉：三偏磷酸鈉=6：1）作為磷酸化試劑對滸苔粗多糖進(jìn)行磷酸化，并通過單因素實驗來確定影響磷酸化反應(yīng)的因素，繼而設(shè)計正交試驗優(yōu)化磷酸化工藝條件。根據(jù)測定經(jīng)修飾后的粗多糖的磷酸根含量來確定結(jié)果。主要研究了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH和混合磷酸鹽濃度對磷酸化反映的影響。單因素實驗結(jié)果：溫度80℃，反應(yīng)時間5h，反應(yīng)pH為9.0混合磷酸鹽濃度0.10g/ml，在此條件下可獲得最大磷酸根接枝量9.386%。而經(jīng)過正交優(yōu)化后確定影響反應(yīng)的因素主次順序為

57、:磷酸化試劑濃度>反應(yīng)pH >反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度,其最優(yōu)組合為反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時間6h，反應(yīng)pH 9.0，磷酸化試劑濃度0.10g/ml，此時最大接枝量可大于等于9.965%。</p><p>　　關(guān)鍵詞 滸苔多糖；磷酸化；工藝優(yōu)化</p><p>　　Abstract In this paper, the phosphorylated polysaccharide

58、was studied. Mixed phosphate(STPP:STMP=6:1) was used as the phosphorylation reagent in the reaction of the phosphorylation of Enteromorpha polysaccharides .And the single factor experiments were done to determine the fac

59、tors of affecting phosphate reaction, followed by orthogonal test to optimize phosphorylation conditions. The results were determined by the quantity of phosphate in the modified and unmodified polysaccharide. Several fa

60、ct</p><p>　　Keywords Enteromorpha polysaccharide；phosphorylation；optimization of processing</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　多糖作為生命活動四大基本物質(zhì)之一, 是一種重要的生物活性成分，在生命活動中發(fā)揮著重要作用。多糖不

61、僅參與細(xì)胞識別、分子識別、生物體受精生長發(fā)育以及免疫過程,而且還發(fā)現(xiàn)了其具有重要的醫(yī)療價值，有抗腫瘤、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。隨著糖生物學(xué)和糖化學(xué)的發(fā)展，多糖的生物活性越來越受到人們的重視，有關(guān)多糖生物活性的研究有了長足的進(jìn)步和發(fā)展。據(jù)研究表明，滸苔水溶性多糖是藥理活性很強的成分,具有很好的降血脂、抗疲勞、抗菌、抗病毒及增強免疫力等多種生物學(xué)活性。富含滸苔水溶性多糖的滸苔(Entermorpha)為綠藻門(Chlorophyta

62、)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaleae)藻類，是野生藻類資源中的優(yōu)勢種。滸苔營養(yǎng)豐富，含多種人體必需的氨基酸、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)。同時，它還含有多種活性功能成分如脂氧合酶和多糖類等，藥用價值較高，開發(fā)潛力巨大。自古以來，滸苔即為食用和藥用藻類，《本草綱目》中記載，滸苔可“燒末吹鼻止衄血；湯浸搗敷手背腫痛”[1-4]。雖然滸苔多糖具有豐富的來源并且具有較高的藥用和食用價值，但由于它的生物活性受分子結(jié)構(gòu)的的影響而大大限制

63、了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，</p><p>　　分子修飾是通過化學(xué)、物理學(xué)及生物學(xué)等手段對化合物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得眾多結(jié)構(gòu)類型衍生物的方法。已完成的研究證實,多糖的活性直接或間接地受到其結(jié)構(gòu)的制約。分子修飾可通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置而對其理化性質(zhì)、生物活性、功能特性產(chǎn)生影響。由此可分析多糖構(gòu)效關(guān)系，并為多糖類藥物及其他多糖產(chǎn)品的設(shè)計提供理論依據(jù)。選擇合適的方法對多糖進(jìn)行分子修飾，

64、可改善其功能特性，提高其生物活性或降低其毒副作用。因此，對多糖進(jìn)行分子修飾已成為多糖構(gòu)效關(guān)系研究的重要手段，也是開發(fā)多糖產(chǎn)品的重要途徑。將多糖或寡糖進(jìn)行衍生化,如降解、硫酸化、磺?；⒁阴；⑼榛?有可能大大提高多糖的生物活性[5]。其它修飾方法,如磷酸酯化、硬脂?；?、棕櫚?；?、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羧乙基化、碘化、氨化等。如對靈芝多糖進(jìn)行硒化研究中將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒不僅提高了吸收硒的能力而且經(jīng)修飾后的靈芝硒多糖抗腫瘤和抗氧

65、化活性均大大提高[6]。李慶偉等還在在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)靈芝硒多糖可明顯增加小鼠血漿和肝GSH-Px、SOD的活性,降低小鼠血漿和肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量,其作用效果明顯強于靈芝多糖[7]。而在對</p><p>　　食品蛋白通過磷酸化引入了大量帶有負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，在溶液中更易分散，從而增加其溶解度；降低了乳化液的表面張力，增加乳化性和乳化穩(wěn)定性；改變了等電點，有效地拓寬了其在食品的應(yīng)

66、用范圍。植物中的淀粉磷酸酯化,使其在黏度、滲透性、凝膠性和吸水性等理化性能上有顯著加強的特點。謝淑蓉[4]等闡述了淀粉磷酸化的機制，主要是利用一種叫做α-葡聚糖水合二激酶(α-glucan water dikinase,GWD)的作用下完成淀粉的磷酸化。 周家春[8]等則以淀粉冷凍狀態(tài)下的持水能力為主要指標(biāo),從磷酸鹽濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、PH值等方面初步研究了磷酸化淀粉制備的工藝條件。以上均是針對蛋白質(zhì)以及淀粉等大分子磷酸化的研究，

67、而國內(nèi)外在多糖磷酸化的研究甚少，因此對蛋白質(zhì)和淀粉的磷酸化研究方法為后面我們探討磷酸化滸苔多糖的工藝條件提供了借鑒意義。與其它大分子的化學(xué)修飾一樣,多糖的磷酸化分子修飾也是一種共價修飾。多糖經(jīng)過磷酸化分子修飾后,支鏈上的羥基被磷酸根取代,從而增強多糖抗腫瘤和抗氧化等的生物活性。Dana等[10]利用微晶纖維素與熔融尿素中的磷酸反應(yīng)，介紹了水溶性纖維素磷酸</p><p>　　本實驗擬采用熱水浸提法提取滸苔粗多糖，

68、繼而從反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH和混合磷酸化試劑濃度等4個對滸苔多糖磷酸化反應(yīng)有影響的方面進(jìn)行單因素實驗，并探討滸苔多糖磷酸化反應(yīng)的條件，通過正交實驗優(yōu)化滸苔多糖磷酸化反應(yīng)的工藝條件。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p><b>　　2

69、.1.1 原料</b></p><p>　　滸苔干品, 由浙江省奉化市騰宇養(yǎng)殖有限公司提供。</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p>　　木瓜蛋白酶 分析純 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司</p><p>　　雙氧水 分析純

70、 宜興市第二化學(xué)試劑廠</p><p>　　無水乙醇 分析純 浙江中星化工試劑有限公司</p><p>　　四水合鉬酸銨 分析純 合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠</p><p>　　對苯二酚 分析純 上海展云化工有限公司</p&g

71、t;<p>　　亞硫酸鈉 分析純 上海硫酸廠</p><p>　　磷酸二氫鉀 分析純 天津市博迪化工有限公司</p><p>　　鄰苯三酚 分析純 上海展云化工有限公司</p><p>　　濃硫酸 分析純

72、 蘭溪市六洞山化工試劑廠</p><p>　　濃硝酸 分析純 蘭溪市六洞山化工試劑廠</p><p>　　濃鹽酸 分析純 浙江中星化工試劑有限公司</p><p>　　三聚磷酸鈉 分析純 天津市博迪化工有限公司</

73、p><p>　　三偏磷酸鈉 分析純 上海晶純試劑有限公司</p><p>　　Tris-Hcl緩沖液</p><p><b>　　2.2 儀器</b></p><p>　　PL4002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p

74、><p>　　PL403電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　DKS-26電熱恒溫水浴鍋 寧波江南儀器廠</p>

75、<p>　　DK-8D三孔電熱恒溫水槽 寧波一恒科技儀器有限公司 </p><p>　　SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 陜西太康生物科技有限公司</p><p>　　超濾實驗裝置 北京旭邦

76、膜設(shè)備有限責(zé)任公司</p><p>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司</p><p>　　H2500R-2湘儀離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司</p><p>　　冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器

77、有限公司</p><p>　　KD723可見分光光度計 上?？频蔷軆x器有限公司</p><p>　　DB-2電熱板 常州國華電器有限公司</p><p>　　PHS-3C酸度計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限

78、公司</p><p>　　WH-3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司</p><p>　　3He通風(fēng)柜 三和實驗室</p><p>　　UNICO紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司</p><

79、;p>　　其他儀器：燒杯、透析袋，超濾離心管、容量瓶、移液槍、錐形瓶、試管、量筒、離心管、玻璃棒、冰箱等等。</p><p><b>　　2.3 實驗方法</b></p><p>　　2.3.1 粗多糖的提取與制備</p><p>　　本實驗采取熱水浸提法提取粗多糖，并用木瓜蛋白酶脫蛋白，30%雙氧水脫色純化粗多糖。具體流程如下：<

80、/p><p>　　滸苔干品—熱水浸提—抽濾—超濾—酶法脫蛋白—雙氧水脫色—抽慮—濃縮—4倍體積95%乙醇沉淀—真空冷凍干燥—滸苔粗多糖—苯酚-硫酸法測多糖含量</p><p>　　具體步驟：滸苔干品粉碎過篩后取20～40目部分,用熱水浸提，。取容積為1L的燒杯，稱取15g滸苔粉，加水溶解，1：75的固液比，并放入溫度為90℃的水浴鍋中水浴4h。4h后取出置于通風(fēng)處冷卻，進(jìn)行抽濾后過3000Da

81、膜超濾。將超濾后的樣液置于溫度為60℃的水浴鍋中，并加入木瓜蛋白酶水浴3.5h，目的是脫蛋白。此處是經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量確定使用木瓜蛋白酶來脫蛋白。然后加入30%雙氧水脫色并放入溫度為60℃的水浴鍋中水浴4h。離心過濾取浸提液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后加4倍體積的無水乙醇沉淀,將醇沉后的多糖醇溶液離心，參數(shù)為5000r/min，20min。將離心后的多糖加水復(fù)溶后再冷凍干燥后即可得到滸苔粗多糖。稱取一定量滸苔粗多糖溶解于蒸餾水中，在恒

82、溫水浴中溶解得到待反應(yīng)液。</p><p>　　2.3.2磷酸化反應(yīng) </p><p>　　向制備好的待反應(yīng)液中加入一定量的磷酸化試劑，在恒溫水浴鍋中充分溶解冷卻后調(diào)節(jié)pH，在一定溫度下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)后樣液用4倍體積乙醇醇沉24h。將醇沉多糖冷凍干燥，再于60℃水浴鍋中加水復(fù)溶，接著將復(fù)溶后的溶液放在透析袋中（截留分子量為10000Da）中用蒸餾水透析2d，透析過程中每隔1-2h更

83、換透析液，以加快透析速度，將透析袋內(nèi)液體濃縮到適量體積后進(jìn)行冷凍干燥得到滸苔粗多糖磷酸化衍生物。</p><p>　　2.3.3 樣品磷酸根的測定 </p><p>　　2.3.3.1磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　采用鉬藍(lán)比色法,原理：樣品經(jīng)灰化后，在酸性溶液中，磷酸鹽與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡藍(lán)色的磷鉬酸銨，遇還原劑后產(chǎn)生亮藍(lán)色絡(luò)合物鉬藍(lán)，比色測定，則可測定

84、出樣品中的磷含量。步驟：以磷酸二氫鉀為標(biāo)準(zhǔn)物，做兩個平行組，分別置于25mL的比色管中,依次加入5% 2.0mL 的鉬酸銨溶液,搖勻,靜置幾秒后,分別加入2% 1.0mL亞硫酸鈉溶液和0.5% 1.0mL的對苯二酚溶液,搖勻,加水至刻度,靜置30min后,以參比調(diào)零,在660nm處測定吸光度,以磷酸根濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　2.3.3.2 樣品磷酸根含量的測定</p

85、><p>　　取適量的樣品于燒杯中,分別加入1mL的濃硝酸和濃硫酸,在電爐上加熱至冒煙,待冷卻后加入1mL的30%的過氧化氫,再緩慢加熱,重復(fù)以上的步驟直至瓶內(nèi)不再冒煙,溶液呈無色透明或淡黃色. 冷卻后加入1mL 6 mol/mL的鹽酸,在電爐上加熱使酸徹底分解,用蒸餾水稀釋到50mL的容量瓶中。取5ml按照鉬藍(lán)比色法的步驟測定磷酸根含量。</p><p>　　2.3.4磷酸化試劑對滸苔粗多糖

86、磷酸化的影響</p><p>　　磷酸化試劑不同可能導(dǎo)致多糖磷酸化反應(yīng)的磷酸根接枝量的差異，將三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉選擇為磷酸化試劑，在總量相同的情況下兩者按照不同比例與多糖進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，測定接枝量后選擇最優(yōu)組合，步驟如下：準(zhǔn)備8個空離心管，編號，滸苔粗多糖并加水溶解制成多糖反應(yīng)樣液，按照以下質(zhì)量比分別加入三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的混合物：7/0,0/7,1/6,2/5,3/4,4/3,5/2,6/1。在溫水浴中

87、溶解，固定磷酸化試劑濃度為0.1g/mL，反應(yīng)時間2h，反應(yīng)pH6.0，用4倍乙醇醇沉24h。冷凍干燥，加水復(fù)溶后透析2d，冷凍干燥，得到滸苔多糖的磷酸化衍生物，消化，將溶液中的有機磷消化為無機磷按照鉬藍(lán)比色法測定樣品中的磷含量。</p><p>　　2.3.5單因素實驗工藝優(yōu)化</p><p>　　影響滸苔粗多糖磷酸化修飾的因素很多。如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH、磷酸化試劑濃度等。為提

88、高滸苔粗多糖的磷酸根含量，采用單因素試驗找出影響滸苔粗多糖磷酸根接枝量的關(guān)鍵因素。</p><p>　　2.3.5.1反應(yīng)溫度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　反應(yīng)溫度是影響磷酸化反應(yīng)的重要因素。根據(jù)上面已選出的混合磷酸化試劑，固定磷酸化試劑濃度為0.1g/mL，反應(yīng)時間2h，反應(yīng)pH6.0，將溫度分別設(shè)置為20℃，40℃，60℃，80℃，90℃，100℃，反應(yīng)2h用4倍乙

89、醇醇沉24h。將醇沉后的多糖冷凍干燥，加水復(fù)溶后透析，冷凍干燥，得到滸苔多糖的磷酸化衍生物，加1ml濃硫酸和1ml濃硝酸消化，將多糖中的有機磷消化為無機磷按照鉬藍(lán)比色法測定樣品中的磷酸根含量。</p><p>　　2.3.5.2反應(yīng)時間對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　在化學(xué)反應(yīng)中時間是一個重要的因素，時間不同最后的結(jié)果也不相同。我們將反應(yīng)時間分別設(shè)置為2h,3h,4h,5

90、h,6h,7h，研究在不同反應(yīng)時間下對滸苔多糖磷酸化反應(yīng)的影響。</p><p>　　步驟：根據(jù)上面選取的磷酸化試劑及其濃度，固定磷酸化試劑濃度為0.1g/mL，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH6.0，在80℃水浴鍋中反應(yīng)2h后加入4倍體積乙醇，醇沉24h。將醇沉后的多糖冷凍干燥，加水復(fù)溶后透析2d，冷凍干燥，得到滸苔多糖的磷酸化衍生物，加1ml濃硫酸和1ml濃硝酸消化，將多糖中的有機磷消化為無機磷按照鉬藍(lán)比色法測定樣品中的磷酸根含

91、量。</p><p>　　2.3.5.3 反應(yīng)pH對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　改變反應(yīng)環(huán)境的pH也可能對反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響。將pH作為單因素考察其對反應(yīng)的影響。步驟：根據(jù)上面選取的磷酸化試劑，固定磷酸化試劑濃度為0.1g/mL，將反應(yīng)樣液加入混合磷酸鹽后，將pH分別調(diào)節(jié)為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0。反應(yīng)溫度80℃，反應(yīng)時間5h，反應(yīng)完成后

92、加入4倍體積乙醇醇沉24h。冷凍干燥，加水60℃水浴中復(fù)溶，放入透析袋中透析2d（每間隔1-2h換水一次），冷凍干燥。加1ml濃硫酸和1ml濃硝酸消化，按照鉬藍(lán)比色法測定磷酸根含量。</p><p>　　2.3.5.4 磷酸化試劑濃度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　在上面步驟中我們選取了兩種磷酸化試劑比例為6：1，但是磷酸化試劑在整個反應(yīng)中所占的比例對滸苔多糖磷酸化反應(yīng)也

93、可能產(chǎn)生影響，因此這里將磷酸化試劑濃度作為單因素，研究它對磷酸化修飾的影響。步驟：在7個離心管中加入相同體積的反應(yīng)樣液后分別加入0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14（g/ml）的混合磷酸化試劑（STPP：STMP=6:1）,調(diào)節(jié)pH6.0，置于80℃水浴鍋中反應(yīng)5h加入4倍體積乙醇，醇沉24h，冷凍干燥，加水復(fù)溶后透析2d，冷凍干燥，得到滸苔多糖的磷酸化衍生物，加1ml濃硫酸和1ml濃硝酸消化，將多糖中的有

94、機磷消化為無機磷按照鉬藍(lán)比色法測定樣品中的磷酸根含量。</p><p>　　2.3.6滸苔粗多糖磷酸化正交試驗工藝優(yōu)化</p><p>　　2.3.6.1正交實驗</p><p>　　根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇混合磷酸化試劑濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及pH四個因素，各取三個水平，采用L9(34)正交實驗設(shè)計，因素水平見表1</p><p>&l

95、t;b>　　表1 因素水平表</b></p><p>　　Table 1 Factor level table</p><p>　　2.3.6.2 驗證試驗</p><p>　　以優(yōu)化所得工藝條件進(jìn)行驗證實驗,每個實驗平行做3份。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p>

96、<p>　　3.1 粗多糖的提取</p><p>　　采用熱水浸提法（工藝參數(shù)為溫度90℃，固液比1：75，時間4h）提取粗多糖得率可達(dá)16.12%。相對于其他對提取滸苔水溶性多糖的研究來說（張智芳等[17]浸提液pH值5.0，溫度70℃，固液比1∶80，提取時間為2h，在此實驗條件下多糖得率為9.48％）提取率較高，提取效果較為顯著。原因可能是提取溫度較高提取時間稍長，使?jié)G苔水溶性多糖溶解更加充分

97、導(dǎo)致最終得率的升高。</p><p>　　多糖的提取方法很多，主要有熱水浸提法、酶法提取、超聲法提取、超臨界萃取法等。但由于熱水浸提法工藝簡單，操作方便，得率較高等優(yōu)點，目前國內(nèi)提取多糖大多采用熱水浸提法，如高夢祥等對海帶多糖的提取中運用了此方法，徐大倫[16]等用熱水浸提法通過單因素實驗確定其最佳提取工藝條件為浸提時間4h,溫度90℃,固液比為1:75.此外張智芳等也用熱水浸提法對滸苔多糖進(jìn)行工藝優(yōu)化，設(shè)計了單

98、因素四水平的正交實驗研究PH、溫度、浸提時間和固液比對多糖得率的影響。多糖與蛋白質(zhì)兩種高分子成分共存，且兩種物質(zhì)分子量相近，另外多糖常常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物，脫蛋白質(zhì)成為多糖純化的一個重要步驟。主要用到的是seveage法，三氯乙酸法、酶法等。通過比較得出采用木瓜蛋白酶脫蛋白既經(jīng)濟(jì)又有效，因此本法中采用木瓜蛋白酶脫蛋白。此外滸苔多糖中還含有大量的色素，色素的取出常采用吸附法（纖維素、硅藻土、高嶺土、活性炭等）、離子交換法、金屬絡(luò)合物法

99、等。</p><p>　　采用熱水浸提法提取滸苔水溶性多糖，操作方便、簡單，成本較低，適合工業(yè)化大規(guī)模提取，對于擴(kuò)大滸苔多糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍也有幫助。</p><p>　　3.2 樣品磷酸根測定</p><p>　　圖1 磷酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.1 The calibration curve of phospha

100、te</p><p>　　磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。對于樣品中的磷酸根含量測定可從下列換算公式中求出磷酸根含量</p><p>　　磷酸根含量（%）=(A-0.0214)/0.3957*10-2/m*100%</p><p>　　其中A為樣品在660nm處測定的吸光度，m為樣品質(zhì)量，g。</p><p>　　為了提供滸苔粗多糖磷酸化修飾后磷酸根含

101、量的對照依據(jù)，本研究在單因素實驗前，首先測定了未經(jīng)磷酸化修飾的滸苔粗多糖的磷酸根含量為：1.850％ 。</p><p>　　3.3磷酸化試劑對滸苔粗多糖磷酸化的影響</p><p>　　圖4 磷酸化試劑對磷酸化反應(yīng)的影響</p><p>　　Fig.4 The effects of phosphorylation reagent on phosphorylatio

102、n</p><p>　　由圖4知，單獨使用這兩種試劑時的磷酸根含量明顯較混合使用的低。這可能是由于兩種試劑共同作用，可以在磷酸化反應(yīng)過程中起到相互催化、互補的作用。然后將兩種試劑按照不同比例的混合物作用于滸苔多糖，發(fā)現(xiàn)對滸苔磷酸化影響并不顯著，其中選擇混合磷酸鹽且兩者質(zhì)量比為6：1作用于滸苔多糖時，可達(dá)到較佳的效果，磷酸根含量可達(dá)到2.64%，因此選擇兩種磷酸化試劑比例6：1的混合磷酸鹽作為滸苔多糖磷酸化反應(yīng)的磷

103、酸化試劑。</p><p>　　3.4單因素實驗工藝優(yōu)化</p><p>　　3.4.1 反應(yīng)溫度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　圖5 反應(yīng)溫度對磷酸根接枝量的影響</p><p>　　Fig.5 The effect of temperature on the amount of phosphate</p>

104、<p>　　由圖5可知反應(yīng)溫度對磷酸化修飾影響顯著，溫度升高時磷酸根含量明顯增加，且增加幅度明顯，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到80℃時磷酸根含量達(dá)到最大，高達(dá)5.044%。這可能是因為溫度升高增加化學(xué)反應(yīng)的能量，是高分子鍵的活性增強，使得滸苔多糖與磷酸化試劑的反應(yīng)機會增加，導(dǎo)致最后的磷酸根含量顯著增高。當(dāng)溫度超過80℃時，磷酸根含量略有下降，初步分析可能有以下兩個原因：溫度過高，大分子多糖產(chǎn)生焦化作用，從而降低了與磷酸化試劑的結(jié)合率；溫度過

105、高，磷酸化試劑間發(fā)生結(jié)合作用，使游離的磷酸化試劑減少，間接降低了磷酸化試劑的濃度。綜合考慮選取80℃作為磷酸化反應(yīng)的溫度條件。</p><p>　　3.4.2 反應(yīng)時間對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　圖6 反應(yīng)時間對磷酸化反應(yīng)的影響</p><p>　　Fig.6 The effects of reaction time on phosphoryl

106、ation</p><p>　　有圖6可知，反應(yīng)時間5h時，磷酸根含量最高。隨著反應(yīng)時間的延長，磷酸根含量呈逐步升高趨勢，這可能是由于反應(yīng)比較充分，磷酸根與滸苔多糖充分接觸磷酸根含量也逐步增大。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到5h后，時間繼續(xù)延長而磷酸根含量反而出現(xiàn)了一些下降趨勢，這可能是由于多糖在高溫下長時間反應(yīng)使多糖發(fā)生降解或者長時間的反應(yīng)使已經(jīng)結(jié)合的磷酸化多糖再次分離從而使磷酸根含量下降。因此確定5h為最佳反應(yīng)時間。<

107、/p><p>　　3.4.3 反應(yīng)pH對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　圖7 反應(yīng)pH對磷酸化根接枝量的影響</p><p>　　Fig7. The effects of pH on phosphorylation</p><p>　　由圖7可知，反應(yīng)pH對磷酸化反應(yīng)后滸苔多糖的接枝量有顯著影響。磷酸根含量在pH為9.0時，達(dá)到最

108、大值，高達(dá)8.75%。這可能是由于在該條件下，pH對磷酸化反應(yīng)的進(jìn)行起到了催化作用，使?jié)G苔多糖鏈上的羥基更易被磷酸根取代，因此使得磷酸根含量大為增加。而在反應(yīng)體系在強酸（pH5.0）或強堿（pH11.0）下反應(yīng)時，磷酸根含量較低,這可能是由于三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉在較低的pH下不穩(wěn)定，會分解成活性較低的焦磷酸鈉和正磷酸鈉，而pH過高會對磷酸化試劑與多糖的酯化反應(yīng)產(chǎn)生不良的影響。三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉兩種磷酸化試劑本身就是良好的緩沖液，因

109、此當(dāng)pH變化時，反應(yīng)后的磷酸根含量也會出現(xiàn)波動。</p><p>　　3.4.4 磷酸化試劑濃度對滸苔粗多糖磷酸化修飾的影響</p><p>　　圖8 磷酸化試劑濃度對磷酸化反應(yīng)的影響</p><p>　　Fig.8 The effects of the concentration of phosphoric acid reagent on phosphorylat