1、木霉（Trichoderma spp.）作為一種重要的生物防治微生物，已普遍應(yīng)用于各種作物病害的防治。然而在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，在病原菌侵染條件下，木霉與宿主植物之間存在復(fù)雜相互作用，尤其木霉-玉米之間的正向或負(fù)向互作對(duì)木霉誘導(dǎo)抗性有明顯影響，因此在病原菌侵染條件下，鑒定調(diào)控木霉-玉米互作的關(guān)鍵基因，對(duì)于揭示木霉誘導(dǎo)玉米抗病性分子機(jī)理具有重要意義。由于玉米彎孢霉葉斑病、小斑病和大斑病是我國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)的主要葉斑病，因此本文重點(diǎn)開展兩部分工作，一

2、是通過REMI 技術(shù)，篩選具有抑菌活性的轉(zhuǎn)化子。二是從木霉-玉米互作角度分析木霉PLA2基因調(diào)控玉米抗葉斑病的分子機(jī)理。
　　 1、本研究首先通過REMI 插入突變技術(shù)，以T43 為出發(fā)菌，分別將pV4-GFP和pV4 轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，獲得了9個(gè)含pV4-GFP的轉(zhuǎn)化子和250個(gè)含pV4的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過繼代培養(yǎng)、PCR 擴(kuò)增，證明線性質(zhì)粒pV4-GFP和pV4 已成功插入木霉基因組DNA。
　　 將菌落形態(tài)發(fā)生較大變化的40

3、 株轉(zhuǎn)化子對(duì)玉米彎孢葉斑病菌（Curvularia lunata），禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），瓜類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）進(jìn)行拮抗活性測(cè)定，最終篩選到了5 株拮抗活性較高的轉(zhuǎn)化子，其對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率顯著高于出發(fā)菌T43。
　　 2、鑒定了康氏木霉（Trichoderma koningii）T30中磷脂酶A2（PLA2）在調(diào)控玉米抗葉斑病中的作用。
　　

4、 利用已獲得的PLA2 敲除子，比較分析了敲除子與出發(fā)菌在生物學(xué)特性方面的差異。
　　 結(jié)果表明：PLA2 敲除子菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為酵母浸出汁，在以蔗糖為碳源和KNO3 為氮源的培養(yǎng)液中產(chǎn)孢最多，且明顯高于出發(fā)菌產(chǎn)孢量。敲除子產(chǎn)生的外切幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均低于出發(fā)菌。敲除子處理玉米根系后，與出發(fā)菌株相比相對(duì)防治效果高達(dá)29.63％，玉米離體葉片經(jīng)PLA2 原核表達(dá)產(chǎn)物處理后再接種彎孢霉，

5、病斑面積與對(duì)照相比有不同程度增加，推測(cè)PLA2 可能以負(fù)調(diào)控方式控制木霉對(duì)玉米彎孢霉葉斑病抗性反應(yīng)。但該基因在木霉誘導(dǎo)玉米抗大斑病和小斑病過程中顯示出正調(diào)控作用，說明該基因的調(diào)控機(jī)理還與玉米病害的種類有關(guān)。
　　 開展了PLA2 負(fù)調(diào)控分子機(jī)理研究。結(jié)果表明：PLA2 敲除子處理玉米根系后，玉米葉片幾丁質(zhì)酶、OPR2基因在RNA 水平表達(dá)量，防御酶系活性和SA 含量均比出發(fā)菌株有不同程度提高，而JA、ABA 含量呈降低趨勢(shì)，PA

6、L、APX、POX1、PR1、AOS、OPR7基因在RNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異。PLA2 可能以負(fù)調(diào)控方式控制SA 在玉米葉片中的積累，而以正調(diào)控方式促進(jìn)JA、ABA 積累。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出發(fā)菌株T30及PLA2 敲除子的發(fā)酵液及菌絲差異蛋白，發(fā)現(xiàn)P82 與T30 發(fā)酵液中差異蛋白有5個(gè)；
　　 T30，P82菌絲總蛋白點(diǎn)分別為90、163個(gè)，二者的電泳圖譜有明顯差異。質(zhì)譜鑒定成功的6個(gè)差異蛋白點(diǎn)中，有1個(gè)敲除子特異