1、<p><b>　　畢業(yè)論文開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　化學(xué)工程與工藝</b></p><p>　　耐爾藍(lán)接技超支化合物用于DNA電化學(xué)傳感器的研究</p><p>　　一、選題的背景、意義</p><p>　　近年來(lái)，人類(lèi)對(duì)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，并在衛(wèi)生防疫、醫(yī)

2、學(xué)診斷等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。在多種DNA檢測(cè)技術(shù)中，DNA生物傳感器代表了一種新的檢測(cè)手段，與傳統(tǒng)診斷技術(shù)相比，它快速、靈敏、操作和儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，尤其是它具有分子識(shí)別功能，在基因診斷、治療，和傳染性疾病檢測(cè)等方面做出了很多貢獻(xiàn)，代表了當(dāng)今生物檢測(cè)技術(shù)的前沿。正在研究和已經(jīng)應(yīng)用的DNA傳感器主要包括壓電式傳感器、化學(xué)發(fā)光(熒光)傳感器、微組裝免疫傳感器、光學(xué)傳感器以及電化學(xué)傳感器等。在DNA雜交及識(shí)別方面，電化學(xué)DNA傳感器成本低，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單

3、，設(shè)備小巧，能耗低，引起人們重視[1]。通常，電化學(xué)DNA傳感器是通過(guò)電極表面同載電化學(xué)指示劑標(biāo)記的ssDNA來(lái)識(shí)別與之互補(bǔ)的目標(biāo)DNA序列。所使用的電化學(xué)指示劑是具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，通常使用二茂鐵，還有鄰苯二胺、陽(yáng)離子金屬?gòu)?fù)合物有機(jī)染料等。但它們往往同時(shí)與ssDNA和dsDNA結(jié)合，選擇性不理想。耐爾藍(lán)用于生物染色，區(qū)別脂肪酸和中性脂肪，病理組織中細(xì)菌和放線菌染色等等方面效果較好，亦有作用為電化學(xué)指示劑的實(shí)際價(jià)值。</p>

4、;<p>　　DNA是一類(lèi)重要的生命物質(zhì)，是大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，對(duì)DNA的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域中極為重要的內(nèi)容，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利實(shí)施，基于DNA探針的基因傳感器、基因芯片的研究正成為基因組研究的一個(gè)熱點(diǎn)，DNA傳感器是用電化學(xué)手段選擇性檢測(cè)DNA的生物傳感器，由已知的DNA片段和電活性指示劑構(gòu)成。利用電活性分子（雜交指示劑）來(lái)指示雜交前后信號(hào)變化，選擇性地識(shí)別靶序列[2]。電化學(xué)DNA傳感器與通常的標(biāo)記（放射

5、性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記等）探針技術(shù)相比，不僅選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)單及價(jià)格低廉，而且有無(wú)可比你的分離純化基因的功能，故可望用于臨床快速檢測(cè)基因疾病，探討各種因素引起的DNA損傷程度和可能的突變機(jī)理以及DNA為作用靶的藥物研究。</p><p>　　二、相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài) </p><p>　　李毓琦[3]等測(cè)試了一種新型的乙型肝炎抗體膜片。測(cè)試時(shí)，僅需將25μl被檢血清滴

6、注于該膜上，經(jīng)孵育與洗滌即可制得抗原與抗體復(fù)合物膜。用復(fù)合物膜組裝成免疫電極．測(cè)定血清樣品中乙型肝炎表面抗原古量。電極的線性范圍是20~320ng/ml，方法的日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.78%(n=4，m=5),對(duì)血清中可能存在的一些其它抗原具有較好的選擇性。105例臨床血清樣本，本法與酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定結(jié)果符合率為86%。乙肝抗體膜片系一次性使用，4℃可保存半年以上。</p><p>　　牛淑妍[4]等在0.

7、2mol/L pH5.0 Na-HAc緩沖溶液中，運(yùn)用電化學(xué)方法和熒光光譜分析法研究了硫堇與鮭魚(yú)精DNA的相互作用。硫堇與DNA作用后，氧化還原峰電流減小，峰電位正移，溴化乙錠(EB)-DNA體系在加入硫堇后出現(xiàn)熒光淬滅的現(xiàn)象。結(jié)果表明，硫堇與DNA的結(jié)合方式主要是嵌插作用。以硫堇為電化學(xué)雜交指示劑，制得了一種DNA電化學(xué)生物傳感器，該傳感器具有良好的選擇性，靶DNA在11.3~121nmol/L范圍內(nèi)具有了良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)

8、0。9971，檢測(cè)限為5.26nmol/L(3σ，n=7)。</p><p>　　劉志敏[5]等以室溫固相合成法制備納米ZnO，通過(guò)殼聚糖(CHIT)的成膜效應(yīng)將納米ZnO固定在玻碳電極(GCE)表面，制得的ZnO/CHIT/GCE電極成為DNA固定和雜交的良好平臺(tái)。DNA的固定和雜交通過(guò)電化學(xué)交流阻抗進(jìn)行表征。以電化學(xué)交流阻抗免標(biāo)記法檢測(cè)目標(biāo)DNA，固定于電極表面的DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后使電極表面的電子傳

9、遞電阻增大，以此作為檢測(cè)信號(hào)可以高靈敏度地測(cè)定目標(biāo)DNA。電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)基因片段的線性范圍為2.0×10-11～2.0×10-6mol/L，檢出限為2.0× 10-12 mol/L。</p><p>　　魏娜[6]等基于急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytie leukemia，APL)中PML/RARA(promyelocytic l

10、eukemia/retinoic acid receptor alpha)融合基因的堿基序列，設(shè)計(jì)了一種新型發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA電化學(xué)探針，并將此探針固定在玻碳電極表面，采用自行合成的硝基吖啶酮(NAD)作雜交指示劑，應(yīng)用循環(huán)伏安法與差分脈沖伏安法實(shí)現(xiàn)了對(duì)人工合成的APL PML／RARA融合基因的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在pH 7.0Tris-HCI緩沖液中，雜交前后NAD氧化峰電流差值與靶標(biāo)鏈濃度在2.0 ×10

11、-8～1.0 ×10-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.0×10-9mol/L。</p><p>　　許世超[7]等構(gòu)建了一個(gè)以亞甲基藍(lán)(MB)為雜交指示劑的電化學(xué)DNA傳感體系：通過(guò)自組裝的方式將巰基改性的單鏈DNA 5’端(HS—ssDNA)連接到金電極表面形成Au—ssDNA，當(dāng)檢測(cè)體系中加入和Au—ssDNA互補(bǔ)的目標(biāo)單鏈DNA(CSS DNA)時(shí)，會(huì)形成一個(gè)雙鏈DNA系

12、統(tǒng)(Au—dsDNA)，加入MB并通過(guò)循環(huán)伏安法檢測(cè)了雜交過(guò)程中的信號(hào)變化，驗(yàn)證了Au—ssDNA及Au．dsDNA的形成。在4.0×10-6～1.0×10-5moL/L內(nèi)，檢測(cè)靈敏度隨MB濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達(dá)到2.0×10-5mol/L時(shí)接近最大值。示差脈沖伏安法檢測(cè)結(jié)果表明，該檢測(cè)體系對(duì)目標(biāo)DNA的選擇性識(shí)別能力高，可區(qū)分具有單堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA序列。檢測(cè)體系對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度隨著目標(biāo)DN

13、A濃度的增加而增加，在5.0×10-10～1.8×10-9moL/L內(nèi)呈線性關(guān)系，計(jì)算所得對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限為5.0×10-10moL/L。使用壽命檢測(cè)表明，經(jīng)過(guò)5次變性/雜交循環(huán)后，檢測(cè)信號(hào)降低并接近于檢測(cè)限。</p><p>　　李金花[8]等研究了DNA夾心雜交和直接雜交體系，將功能化納米金引入到標(biāo)記有生物素的雜交雙鏈上，制成具有電化學(xué)活性和納米金放大作用的DNA電化學(xué)傳感器

14、，采用循環(huán)伏安法測(cè)試/在夾心雜交體系中，靶點(diǎn)DNA濃度與陽(yáng)極峰電流關(guān)系曲線的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%~13.0%，在濃度為6.9×10-3~0.14nmol/L范圍內(nèi)得到良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限達(dá)到2.0×10-3nmol/L實(shí)現(xiàn)了對(duì)單堿基突變的高靈敏檢測(cè)和序列識(shí)別。直接雜交檢測(cè)限為2.5×10-4分別在2.5×10-4~5.0×10-3nmol/L和5.0×10-3~10nmol

15、/L范圍內(nèi)得到峰電量與濃度的良好線性關(guān)系。并比較這兩種體系。</p><p>　　王桂香[9]等用溶膠-凝膠法在玻碳電極上制備了納米多孔羥基磷灰石(Hap)-聚乙烯醇(PVA)涂層膜固定雙鏈DNA，得到了一種新型DNA電化學(xué)傳感器，檢測(cè)了由Fenton反應(yīng)引起的DNA氧化性損傷。結(jié)果表明，一定量濃度的抗壞血酸(AA)能加速Fenton反應(yīng)的進(jìn)行，使DNA損傷很快達(dá)到極限；損傷試劑中Fe2+的濃度越大，產(chǎn)生的羥基自

16、由基(OH·)越多，對(duì)DNA的損傷就越嚴(yán)重；損傷試劑中EDTA的濃度越小，溶液中游離的Fe2+以及與DNA鍵合的Fe2+的濃度則相對(duì)越大，對(duì)DNA的損傷也就越嚴(yán)重。</p><p>　　Lei Yang[10]等通過(guò)固定兩種納米ZnO的方法構(gòu)建了轉(zhuǎn)移ZnO生物傳感器和增長(zhǎng)ZnO生物傳感器。并且系統(tǒng)地研究和比較了不同的生物傳感器之間的性能。增長(zhǎng)ZnO生物傳感器的靈敏度高出轉(zhuǎn)化ZnO生物傳感器52%。相應(yīng)的

17、，其他性能也是增長(zhǎng)ZnO生物傳感器更好一些，包括響應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)極限和線性范圍。試驗(yàn)結(jié)果和更多葡萄糖氧化酶被固定在原ZnO陣列的實(shí)際一致，并有更大的比表面積和更直接的電子通道。</p><p>　　Pauliukaite, Rasa[11]等利用殼聚糖(Chit)薄膜修飾石墨環(huán)氧樹(shù)脂復(fù)合材料(GrEC)電極用于電化學(xué)阻抗譜(EIS)。少量薄膜修飾并使用了不同的交聯(lián)劑：戊二醛(GA)，乙二醛(GO)，表氯醇(ECH)

18、和1-乙基-3-(3-二甲氨基) 碳化二甲基氨(EDC)和亞胺(NHS)在有電活性的鐵氰化鉀(Ⅲ)和氯化hexaammineruthenium(Ⅲ)下一起評(píng)估每個(gè)的特性。固定碳納米管到殼聚糖模型(Chit-CNT)使用了相同的交聯(lián)劑也同樣進(jìn)行了研究。電極的阻抗性能與(GrEC/Chit-CNT/EDC-NHS)特性一樣好并被視為安乃近的傳感器和對(duì)苯二酚以及為在葡萄糖傳感器殼聚糖模型頂部使用戊二醛固定葡萄糖氧化酶(GOx)。對(duì)模型和等效電

19、路進(jìn)行了分析，并重點(diǎn)對(duì)擴(kuò)散特性和光譜特征進(jìn)行了討論。</p><p>　　白燕[12]等利用自組裝單分子膜技術(shù)將巰己基修飾的單鏈DNA固定在金電極表面，以電活性的Hoechst33258為指示劑，考察了單鏈DNA修飾電極(ssDNA/Au電極)、雙鏈DNA修飾電極(dsDNA/Au電極)的指示劑氧化峰電流，并利用其差值(△ip)與互補(bǔ)DNA濃度成線性關(guān)系對(duì)待測(cè)DNA濃度進(jìn)行定量。因此，DNA電化學(xué)傳感器可用于特定

20、DNA序列的識(shí)別和測(cè)定。</p><p>　　三、課題的研究?jī)?nèi)容及擬采取的研究方法（技術(shù)路線）、難點(diǎn)及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)</p><p><b>　　1、課題的研究?jī)?nèi)容</b></p><p>　　利用超技化合物中的大量活性基團(tuán)接枝活性染料，使嵌入DNA的指示劑有更多的電活性基團(tuán)暴露在外面，在溶液中的電信號(hào)會(huì)大幅度增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)超靈敏的電化學(xué)檢測(cè)目

21、的。探討反應(yīng)條件，并研究影響測(cè)定的干擾因素，建立一種測(cè)定特定序列DNA的新方法，</p><p>　　2、擬采取的研究方法、技術(shù)路線及研究難點(diǎn)：</p><p>　　2.1 單鏈DNA電化學(xué)生物電極的制備；</p><p>　　2.2 研究雜交DNA在電極表面的響應(yīng)以及嵌入染料-超支化合物在電極表面的電化學(xué)信號(hào)；</p><p>　　2.3

22、研究實(shí)驗(yàn)的條件改進(jìn)和電極的優(yōu)化；</p><p>　　2.4 建立一種新型DNA電化學(xué)生物傳感器。</p><p><b>　　研究難點(diǎn)：</b></p><p>　　DNA電極的制備與性能研究。</p><p>　　四、論文詳細(xì)工作進(jìn)度和安排</p><p>　　1、2011年3月1日—2011

23、年3月15日：完成資料的檢索和整理及匯總。</p><p>　　2、2011年3月19日—2011年3月23日：完成開(kāi)題報(bào)告及答辯工作。</p><p>　　3、2011年3月26日—2011年5月20日：基本完成論文所需的實(shí)驗(yàn)工作。</p><p>　　4、2011年5月21日—2011年5月30日：完成論文的寫(xiě)作以及答辯工作。</p><p&

24、gt;<b>　　五、主要參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 崔康. 新型電化學(xué)傳感器的研究. 江西師范大學(xué)-碩士學(xué)位論文.2009</p><p>　　[2] 徐桂云. DNA電化學(xué)傳感器的制備及其在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng). 中國(guó)海洋大學(xué)-博士學(xué)位論文.2007</p><p>　　[3] 李毓琦，陳開(kāi)全，何俊，魏素萱，牟家婉，肖

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27、器. 精細(xì)化工 2008.25(12):1184-1197</p><p>　　[8] 李金花，胡勁波，丁小勤，李啟隆. 功能化納米金放大的DNA電化學(xué)傳感器研究. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào).2005.26(8):1432-1436</p><p>　　[9] 王桂香，潘芊秀，王懷生. 新型DNA電化學(xué)傳感器的研制及其用于DNA氧化性損傷檢測(cè)的研究. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào).2005.26(10):18

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