1、<p>　　阻斷沉默CXCR4基因表達(dá)抑制胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn)研究</p><p>　　王 錚，李徐奇，徐 軍，仵 正，張 東，沙煥臣，馬清涌 (710061 西安，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科)</p><p>　　[摘要] 目的 利用RNAi技術(shù)構(gòu)建CXCR4 shRNA表達(dá)載體，觀察CXCR4基因干擾后胰腺癌細(xì)胞增殖、及侵襲能力的變化。方法

2、 在不同分化程度胰腺癌細(xì)胞株中篩選出CXCR4高表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株，RNAi技術(shù)構(gòu)建CXCR4 shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胰腺癌CXCR4高表達(dá)細(xì)胞Miapaca-2并應(yīng)用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，Real-time PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)觀察RNAi對(duì)CXCR4基因的抑制效率；MTT實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)CXCR4基因干擾后胰腺癌細(xì)胞增殖，應(yīng)用Transwell侵襲小室觀察CXCR4干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力的影響。P<0.05被

3、認(rèn)為具有顯著差異性。結(jié)果 胰腺癌細(xì)胞株Miapaca-2 CXCR4表達(dá)異常增高，特異性CXCR4基因沉默能夠在基因和蛋白水平穩(wěn)定、高效、特異地抑制CXCR4的表達(dá)，抑制效率達(dá)70%以上，。同時(shí)，特異性CXCR4 shRNA能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，此外，。Transwell實(shí)驗(yàn)證明CXCR4基因干擾后細(xì)胞侵襲能力減低 (P<0.05)，即使SDF-1的刺激也不能夠使細(xì)胞侵襲能力增加。結(jié)

4、論 </p><p>　　[關(guān)鍵詞] CXCR4; 胰腺癌; 侵襲轉(zhuǎn)移</p><p>　　[中圖法分類號(hào)] R735. 9 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A</p><p>　　The effects of CXCR4 inhibited by RNA interference on pancreatic cancer proliferation a

5、nd in vitro </p><p>　　Wang Zheng, Li Xuqi, Xu Jun, Wu Zheng, Zhang Dong, Sha Huanchen, Ma Qingyong (Department of Hepatobilary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical College of Xi’an Jiaotong U

6、niversity, Xi’an, Shaanxi, 710061, China) </p><p>　　[Abstract] Objective Extra-pancreatic metastasis is a difficult problem for surgical intervention on pancreatic cancer. CXCR4 was considered as an importan

7、t role in this process. The aim was to observe the influence of CXCR4 knockdown on pancreatic cancer cell growth, cell cycle, cell tumorigenesis, cell invasive ability. Methods RNAi technique was applied to construct the

8、 CXCR4 shRNA expression vector. Lipofecatime 2000 was used to transfect the CXCR4 high expression pancreatic cancer cell Miap</p><p>　　[Key Words] CXCR4; Pancreatic cancer; Tumor invasion and metastasis</

9、p><p>　　Supported by the National Natural Science Foundation of China (81172195, 30700817). The Fundamental Funding of Xi’an Jiaotong University (2010, No 05). Corresponding author: Qingyong Ma, Tel:029-8532389

10、9, E-mail:qyma56@mail.xjtu.edu.cn</p><p>　　問題1：請(qǐng)補(bǔ)充基金項(xiàng)目及通信作者英文信息，與中文寫法一一對(duì)應(yīng)</p><p>　　[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)青年基金（81172195,30700817），2010西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究基金（問題2：補(bǔ)充項(xiàng)目編號(hào)或者年分）基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)國(guó)內(nèi)外合作項(xiàng)目（2011，No.05）</p>&

11、lt;p>　　[通信作者] 馬清涌，電話:（029）85323899, E-mail:qyma56@mail.xjtu.edu.cn</p><p>　　胰腺癌惡性度高，早期容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，死亡率居世界癌癥死亡第4位。胰腺癌根治性手術(shù)切除率低，5年生存率不足5%，外科手術(shù)往往不能夠得到滿意的效果[1-2]。隨著分子生物學(xué)手段的不斷進(jìn)展，生物治療越來越多的得到了人們的重視，針對(duì)血管生成、表皮生長(zhǎng)因子等多個(gè)

12、途徑的藥物已經(jīng)進(jìn)入了不同的臨床階段[32]。在針對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移研究中，趨化因子的作用是目前的研究熱點(diǎn)，由于趨化因子能夠誘導(dǎo)具有相關(guān)受體的腫瘤細(xì)胞游走到特異的器官，，調(diào)控趨化因子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要的途徑[43]。胰腺癌常發(fā)生肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移，而在肝臟、肺臟等組織中基質(zhì)源性細(xì)胞因子1（問題3：首次出現(xiàn)的英文縮寫請(qǐng)給出其中英文全稱）SDF-1（Stromal derived factor-1, SDF-1,又名CXCL12）呈現(xiàn)高

13、表達(dá)。CXCR4是SDF-1已知的唯一的趨化因子受體[54]。（問題4：引用文獻(xiàn)？）課題組前期結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胰腺癌組織中異常表達(dá)，并且與胰腺癌預(yù)后明確相關(guān)[5]。因此，以CXCR4作為胰腺癌基因治療靶點(diǎn)具有一定的作用臨床應(yīng)用前景。由于RNAi提供了一種特異性基因功能失活的方法，可以作為一種簡(jiǎn)單有</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p

14、>　　1.1 主要試劑與材料</p><p>　　不同分化程度的胰腺癌細(xì)胞（PC-2, PC-3, Miapaca-2, BXPC-3, PANC-1）由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ及膠回收試劑盒（TaKaRa公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofeetamine 2000(Invitrogen公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(天跟生化科技有限公司)，寡核苷酸及測(cè)序(上海生工

15、合成)，Real-time PCR反應(yīng)體系(MBI公司)，G418及DMEM（Gibco公司），兔抗人CXCR4（Neomarker公司）及HRP-羊抗兔抗體(中杉公司)。碘化丙啶(PI)及Hoechest染料(碧云天公司)。載體pRNAT-U6.1/Neo由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室李旭教授饋贈(zèng)。</p><p>　　1.2 Real-time PCR檢測(cè)CXCR4 mRNA表達(dá)</p&g

16、t;<p>　　按Trizol試劑盒說明使用氯仿和異丙醇抽提總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，采用Oligo DT和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA鏈。PCR引物采用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。Real-time PCR在ABI7300機(jī)器上進(jìn)行反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作同前，采用兩步法，進(jìn)行所需擴(kuò)增的基因引物擴(kuò)增如下：。（問題5：請(qǐng)標(biāo)明5’與3’端）CXCR4上游, F: 5′-CTGTGAGCAGAGGGT

17、CCAG-3'; R: ，下游：5′-ATGAATGTCCACCTCGCTT-3'; GAPDH: F上游: 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游; R: 5′- GCCCAATA CGACCAAATCC-3'。反應(yīng)條件設(shè)置如下：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃，15 s；60℃，60 s；40個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s。Real-time

18、- PCR反應(yīng)完成后，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的溶解曲線反應(yīng)用來反映擴(kuò)增的特異程度。待測(cè)基因的表達(dá)水平通過2?ΔΔCT（即與管家基因ct值差值的差值）方法進(jìn)行檢測(cè)[7]。</p><p>　　1.3 Western blot檢測(cè)CXCR4蛋白表達(dá)</p><p>　　胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%后，經(jīng)PBS漂洗，然后將預(yù)冷至4 ℃的RIPA裂解緩沖液（用時(shí)加入Cocktail proteinase inhi

19、bitor 10 µl以及適量PMSF）加入其中，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，冰浴30 min，12 000 r／min離心15 min后，上清液保存于-80℃。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每孔上樣40 µg，10％SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。后者在含5％脫脂奶粉的TBST中37 ℃封閉2 h，加入以封閉液稀釋的一抗（CXCR4，1:200；GAPDH:

20、1:400），封閉雜交袋，4 ℃過夜。TBST充分漂洗(15 min×3次)，分別加入以牛奶封閉的HRP標(biāo)記二抗（anti-rabbit:1:1500，anti-mouse 1:2000），室溫下孵育2h；TBST充分漂洗(20 minx min，3次)，化學(xué)熒光法(ECL)顯色，觀察結(jié)果。凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，蛋白表達(dá)以光密度表示，以目的蛋白/GAPDH表示蛋白的相對(duì)表達(dá)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并拍照。</p

21、><p>　　1.4 設(shè)計(jì)和構(gòu)建CXCR4 shRNA表達(dá)載體</p><p>　　從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得人CXCR4 mRNA的基因序列，共有2個(gè)序列，其中NM_003467是目前人CXCR4 mRNA研究最多的序列。依據(jù)Tuschl等[8]關(guān)于siRNA的設(shè)計(jì)原則，利用互聯(lián)網(wǎng)上軟件程序設(shè)計(jì)針對(duì)CXCR4 mRNA（NM_003467）

22、基因CDS區(qū)的siRNA的序列，利用BLAST比較設(shè)計(jì)的序列和人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，排除和其他基因明顯同源的靶序列，設(shè)計(jì)3條序列，其中包括2條CXCR4 mRNA的Oligo序列（1#，2#）和1條作為負(fù)對(duì)照的無關(guān)序列（N#）。（問題6：請(qǐng)寫明大小寫區(qū)別想說明什么？）1#正義鏈：5′-gatccgTGAGAAGCATGACGGACAAttcaagagaTTGTC CGTCATGCTTCTCA tttttggaaa-3'3，反義鏈：5

23、′-agcttttccaaaaaaTGAGAAGCATGACGGACAA tctcttgaaTTGTCCGTCATGCTTCTCA cg-3'；2#正義鏈：5′-gatccAGCGAGGTGGACATTCA TCttcaagagaGATGAATGTCCAC</p><p>　　1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及CXCR4 shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的建立</p><p>　　參照Lipofectami

24、ne2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10%FBS，無抗生素的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×105/ml，以0.5 ml/孔于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，Miapaca-2細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到70%左右融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，按1：10接種于6孔板，用含10% FBS，無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加G418 400 µg/ml進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

25、篩選，每3～5日換液；2～3周后，6孔培養(yǎng)板出現(xiàn)多個(gè)G418抗性的克隆，由于質(zhì)粒帶有GFP的表達(dá)，在鏡下可看到帶綠色熒光的陽(yáng)性克隆。顯微鏡下，用小槍頭吸取少量胰酶，進(jìn)行消化挑取帶綠色熒光的單個(gè)克隆；挑取的克隆移入24孔培養(yǎng)板，G418培養(yǎng)基200 μg/ml進(jìn)行繼續(xù)維持培養(yǎng)，經(jīng)過8周周可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。必要時(shí)通過有限稀釋法再次篩選單克隆陽(yáng)性細(xì)胞，在96孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。</p><p>　　1.6 MTT法

26、檢測(cè)特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用</p><p>　　細(xì)胞1×104/孔接種于5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液，每孔體積200 µl；將培養(yǎng)板移入37 ℃，飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)；分別在24、48、72、96 h和120 h后，每孔加入MTT溶液5 mg/ml 20 µl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄上清后加

27、入150 µl DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析儀測(cè)定D(490)值；以只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔調(diào)零，以空白對(duì)照孔調(diào)零，于自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀上測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的平均值；記錄結(jié)果，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。</p><p>　　1.7 Transwell小室檢測(cè)CXCR4干擾后胰腺癌細(xì)胞Miapaca-2細(xì)胞侵襲能力</p>&l

28、t;p>　　Boyden小室分為上、下兩室，中間為孔徑為8 μm的聚碳酯膜，膜的上室可以鋪基質(zhì)凝膠（Matrigel）。將各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞消化，以無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5×105/ml備用；以200 µl無血清的DMEM培養(yǎng)液水化Transwell小室，盡量吸盡小室內(nèi)殘留的培養(yǎng)液；吸取400 µl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室；Transwell小室的下室加入10% FBS的

29、DMEM培養(yǎng)基或含100 ng/ml SDF-1α和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基作趨化液；將細(xì)胞置于37 ℃，CO2孵箱培養(yǎng)20 h；取出小室，以棉簽小心擦除濾膜上室面的細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定黏附在下室面的細(xì)胞；Giemsa（1：9稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配）染色；顯微鏡下觀察處于微孔濾膜外側(cè)面上的細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)濾膜下表面的遷移到了的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。以穿出細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲

30、能力。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。</p><p><b>　　1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</b></p><p>　　采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析并應(yīng)用LSD法行兩兩比較（問題7：兩兩比較用什么檢驗(yàn)？）。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p&

31、gt;<p>　　2.1 CXCR4在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)</p><p>　　應(yīng)用五5種具有不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行CXCR4 mRNA以及蛋白表達(dá)的檢測(cè)。應(yīng)用Western blot以及Real-time PCR結(jié)果顯示，CXCR4 mRNA在胰腺癌細(xì)胞中具有不同程度的表達(dá)，其中Miapaca-2和PANC-1細(xì)胞CXCR4 mRNA水平表達(dá)較高（圖1），。在蛋白水平的檢測(cè)方面， Mia

32、paca-2細(xì)胞CXCR4蛋白具有明顯高表達(dá)（圖22）。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，應(yīng)用CXCR4高表達(dá)的Miapaca-2細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行研究。（問題8：請(qǐng)附電泳圖片）</p><p>　　2.2. 特異性CXCR4 shRNA表達(dá)載體的鑒定</p><p>　　經(jīng)過BamHI 和 HindIII的酶切后的質(zhì)粒只剩下線形結(jié)構(gòu)，酶切后質(zhì)粒大小以及插入片段大小得到了確認(rèn)。對(duì)酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序（

33、圖3），測(cè)序結(jié)果如插入片段完全一致的，表明重組成功，分別命名為pRNAT-M1（轉(zhuǎn)染1#質(zhì)粒），pRNAT-M2（轉(zhuǎn)染2#質(zhì)粒），pRNAT-MN（轉(zhuǎn)染N#質(zhì)粒）。</p><p>　　2.3 特異性CXCR4 shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Miapaca-2細(xì)胞</p><p>　　構(gòu)建的質(zhì)粒帶有GFP基因，因此可以在熒光顯微鏡下觀察綠色的表達(dá)。G418篩選濃度為400 μg/ml。從轉(zhuǎn)染后24

34、h開始應(yīng)用熒光纖維顯微鏡（問題9：？？？）觀察，24h Miapaca-2的轉(zhuǎn)染效率為20%～30%，；轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過G418篩選，單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，表達(dá)GFP的細(xì)胞逐漸增加，不表達(dá)的細(xì)胞逐漸減少。經(jīng)過2次有限稀釋法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單克隆的篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)后，鏡下可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞90%以上表達(dá)綠色熒光蛋白（圖43）。</p><p>　　2.4 特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)

35、的抑制作用</p><p>　　轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的pRNAT-MN CXCR4 mRNA水平下降不明顯(P>0.05)，而利用Realtime PCR方法檢測(cè)shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞CXCR4 mRNA的抑制作用。應(yīng)用 2?ΔΔCT 方法利用對(duì)GAPDH和CXCR4 mRNA的ct差值進(jìn)行分析，如圖5所示，pRNAT-M1、pRNAT-M21的CXCR4 mRNA水平都明顯下降，pRNAT-M1最為明

36、顯其中pRNAT-M1、pRNAT-M2的CXCR4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.21±0.03,、0.38±0.04。與pRNAT-MN相比，pRNAT-M1的CXCR4 mRNA抑制效率約70%(P<0.01)，且抑制效果較pRNAT-M2強(qiáng)，抑制率達(dá)到70%左右(P<0.05)，因此。見圖5。用pRNAT-M1進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.5 特異性CXCR4 sh

37、RNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的抑制作用</p><p>　　通過提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析，如圖4可見，我們應(yīng)用GAPDH作為內(nèi)參控制樣品的內(nèi)部質(zhì)量，通過將目的蛋白與GAPDH對(duì)比，數(shù)據(jù)顯示pRNAT-M1、pRNAT-M2的CXCR4 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.29±0.02,、0.57±0.03，GAPDH在各組之間無明顯變化，pRNAT

38、-MN與Miapaca-2的CXCR4蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；而與pRNAT-MN相比，可見pRNAT-M1細(xì)胞CXCR4表達(dá)受到了顯著的抑制（P<0.05）（P<0.05，圖6），并且1號(hào)質(zhì)粒能夠得到最佳的沉默效率，與Realtime-PCR結(jié)果一致。</p><p>　　2.6 特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 </p><p

39、>　　用MTT比色法比較RNAi干擾前后細(xì)胞增殖能力的變化。pRNAT-M1組細(xì)胞的增殖速度比正常細(xì)胞和負(fù)對(duì)照組細(xì)胞顯著減慢，通過對(duì)OD值的分析，我們發(fā)現(xiàn)從第4天開始pRNAT-M1與pRNAT-MN之間具有顯著性差異(P<0.05)，并隨之時(shí)間的延長(zhǎng)差異增加，而pRNAT-MN與正常細(xì)胞之間沒有明顯的差異（圖75）。這一結(jié)果提示，這種結(jié)果說明CXCR4基因被干擾后，Miapaca-2細(xì)胞增殖能力降低。</p>

40、<p>　　2.7特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞侵襲力的影響</p><p>　　采用Transwell小室來檢測(cè)CXCR4基因干擾前后細(xì)胞侵襲力的情況，在正常10%FBS的DMEM培養(yǎng)基趨化下，pRNAT-M1細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)為38.02±8.32, pRNAT-MN細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)為47.35±4.64，pRNAT-M1細(xì)胞通過小室人工基底膜的細(xì)胞

41、數(shù)與pRNAT-MN相比明顯減少(P<0.05)。利用CXCR4目前發(fā)現(xiàn)的唯一的配體SDF-1進(jìn)行趨化，可以看到pRNAT-M1、pRNAT-MN的細(xì)胞穿膜數(shù)分別為41.27±7.21、86.28±6.17，pRNAT-MN細(xì)胞穿透能力明顯增強(qiáng)（P<0.05），而pRNAT-M1細(xì)胞并沒有明顯改變 (P>0.05)。，見圖86。</p><p><b>　　3 討論

42、</b></p><p>　　RNAi即RNA干擾技術(shù)，是一種可靠的阻止或抑制基因表達(dá)的方法，指一些小的雙鏈RNA可以特異、高效地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使其降解，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)出特定基因缺失的表型，由于這是一種在RNA水平的基因表達(dá)抑制，故稱為RNA干擾。雙鏈RNA可以干擾細(xì)胞內(nèi)同源基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象由Fire等在1998年對(duì)線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)的[9，10]。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用Genbank檢索相關(guān)

43、序列，根據(jù)Tuschl等的“The siRNA user guide”原則，針對(duì)CXCR4（NM_003467）選擇并設(shè)計(jì)2條靶序列和1條無相關(guān)序列。一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)均設(shè)有無相關(guān)序列作為負(fù)對(duì)照以驗(yàn)證其特異性。作為負(fù)對(duì)照和選中的序列有相同的核苷酸組成，但是和任何基因沒有同源性。在發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸的設(shè)計(jì)及合成時(shí)，根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)兩個(gè)反向互補(bǔ)排列的DNA模板單鏈，其間應(yīng)用LOOP相連接，形成莖環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。關(guān)于LOOP的脫

44、氧核昔酸的數(shù)量與siRNA干擾效果的問題文獻(xiàn)報(bào)道不一，但多傾向于9個(gè)脫氧核苷酸LOOP的siRNA干擾效果較好。所以，在本實(shí)驗(yàn)中采用了TTCAAGAGA的脫氧核苷酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)的來形成shR</p><p>　　近年研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)腫瘤細(xì)胞都表達(dá)有廣泛的趨化因子及趨化因子受體，并受趨化因子及其受體生物體系的調(diào)控在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中趨化因子受體及其配體表現(xiàn)出重要的作用[118]。因此，以趨化因子及其受體分子為控制靶點(diǎn)

45、，通過激活或拮抗趨化因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)來控制趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于控制和治療相關(guān)疾病，具有潛在的臨床應(yīng)用前景[129]。最初CXCR4引起人們的關(guān)注是由于其在HIV感染中重要作用，；隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CXCR4是組織表達(dá)最為廣泛的細(xì)胞因子受體之一，在多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移都有很重要的作用。CXCR4與SDF-1相互作用可以促進(jìn)局部新生血管作用，利于腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤組織CXCR4表達(dá)明顯高于正常組織，而其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位均為SDF

46、-1表達(dá)豐富的器官，從而定向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特定的靶器官；。SDF-1與CXCR4結(jié)合后可使細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲聚合，可形成假偽足，定向遷移、侵襲，形成“趨向性學(xué)說”[13]。許多惡性腫瘤如前列腺癌、腎癌、喉癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中異常表達(dá)CXCR4[1410-14]。Muller等發(fā)現(xiàn)CXCR4在一些惡性乳腺癌</p><p>　　前期研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胰腺癌組織中異常表

47、達(dá)，并且與預(yù)后明顯相關(guān)[19]。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用五5種不同分化程度的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行CXCR4表達(dá)的檢測(cè)，在研究中我們發(fā)現(xiàn)未分化的Miapaca-2 CXCR4 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯升高，由于五種胰腺癌細(xì)胞分化程度不一，Miapaca-2細(xì)胞為未分化胰腺癌細(xì)胞，考慮惡性度較高胰腺癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4更高。在實(shí)驗(yàn)中，此外，我們成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/ Neo-CXCR4 shRNA，經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofecta

48、mine2000轉(zhuǎn)染Miapaca-2細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染率較低約（20%-30%，）。為了克服瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在的轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)不長(zhǎng)久且不穩(wěn)定等特點(diǎn)，我們?cè)谒矔r(shí)轉(zhuǎn)染后48h開始進(jìn)行G418篩選，在這種篩選壓力下，由于抗性基因的作用，表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞將會(huì)被保留，未轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的細(xì)胞將會(huì)被殺死，最終篩選出穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的Miapaca-2細(xì)胞。經(jīng)過反復(fù)的有限稀釋單克隆化，在熒光顯微鏡和G418篩選的壓力下，獲得了能夠了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。</p

49、><p>　　利用Realtime-PCR方法和Western blot檢測(cè)特異性CXCR4 shRNA對(duì)CXCR4 mRNA和蛋白的抑制效果。結(jié)果表明，CXCR4 shRNA均表現(xiàn)出顯著的抑制能力，以1號(hào)質(zhì)粒最為突出，抑制效率約70%，與負(fù)對(duì)照組和正常細(xì)胞CXCR4的表達(dá)具有明顯的差異性；根據(jù)抑制強(qiáng)度我們采用1號(hào)質(zhì)粒作為主要的研究對(duì)象，來進(jìn)一步研究特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞的影響。國(guó)內(nèi)外研

50、究表明，以SDF-1/CXCR4為代表的趨化因子家族在介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移等信號(hào)傳遞中起著非常重要的作用。CXCR4作為腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)，越來越多被人們所關(guān)注[20]。為了給以CXCR4為靶點(diǎn)的基因治療在胰腺癌中的作用提供理論支持，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，我們通過MTT比色法測(cè)定特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞增殖能力的影響，并繪制出實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，CXCR4 shRNA組與負(fù)對(duì)照組和正

51、常細(xì)胞相比，增殖能力顯著下降，曲線平緩，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較慢，而無義序列組與正常細(xì)胞組相比無明顯的差異性，增殖是腫瘤生長(zhǎng)的一個(gè)特性，CXCR4的基因沉默能夠</p><p>　　綜上所述，在CXCR4沉默的胰腺癌細(xì)胞株中，胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到了有效的抑制。這為CXCR4作為胰腺癌基因治療的靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CXCR4有望成為胰腺癌治療中一個(gè)新的新治療靶位，靶向胰腺癌CXCR4基因治療顯示出了潛在

52、的療效和良好的發(fā)展應(yīng)用前景。</p><p>　?。▎栴}12：討論請(qǐng)重新梳理。請(qǐng)結(jié)合本研究結(jié)果，引用文獻(xiàn)，展開比較分析。避免文獻(xiàn)綜述。）</p><p>　　參考文獻(xiàn)：(問題13：文獻(xiàn)陳舊，請(qǐng)補(bǔ)充近3年文獻(xiàn)。請(qǐng)引用本刊近2年相關(guān)文獻(xiàn)，并在文中順序標(biāo)引)</p><p>　　趙玉沛. 胰腺癌診斷與治療的現(xiàn)狀與未來[J]. 中華肝膽外科雜志，2009, 15(5):32

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83、me-PCR分析CXCR4 mRNA在五種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)；</p><p>　?。≒C-2：2.49±0.11，</p><p>　　PANC-1：2.73±0.26</p><p>　　PC-3：1.0±0.05</p><p>　　BXPC-3：0.87±0.11</p><

84、p>　　Miapaca-2： 2.91±0.22</p><p>　　1:PC-2; 2:PC-3;3:Miapaca-2;4:BXPC-3;5:PANC-1</p><p>　　圖2. Western Blot分析CXCR4蛋白在五種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)</p><p>　　圖3 1#，2#，N#質(zhì)粒G418篩選后細(xì)胞普通顯微鏡（上）和熒光顯微鏡

85、下（下）觀察（×40）</p><p><b>　　標(biāo)尺：100μm</b></p><p>　　1: pRNAT-M1; 2: pRNAT-M2; 3: pRNAT-MN; 4 : Miapca-2</p><p>　　圖4 特異性CXCR4 shRNA對(duì)Miapaca-2細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的作用</p>

86、<p>　　圖5 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞體外MTT法增殖能力比較</p><p>　　Miapaca-2: 24h, 0.982±0.105; 48h, 1.250±0.115; 72h, 1.838±0.103; 96h, 2.43±0.319; 120h, 3.17±0.198</p><p>　　pRNAT-MN: 24h,

87、0.933±0.088; 48h, 1.296±0.124; 72h, 1.855±0.149; 96h, 2.397±0.204; 120h, 3.073±0.278</p><p>　　pRNAT-M1: 24h, 0.890±0.139; 48h, 1.285±0.237; 72h, 1.621±0.314; 96h, 1.

88、850±0.467; 120h, 2.350±0.334</p><p>　　a, pRNAT-MN在10%FBS的培養(yǎng)基；b, pRNAT-MN在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基；</p><p>　　c, pRNAT-M1在10%FBS的培養(yǎng)基；d, pRNAT-M1在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基。</p>

89、<p>　　圖6 Transwell分析不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞之間侵襲能力的比較 (Giemsa染色，×200). 標(biāo)尺：100μm</p><p>　?。▎栴}14：語(yǔ)言精練不夠，不少語(yǔ)句重復(fù)，請(qǐng)通讀全文精練文字）</p><p>　?。▎栴}15：圖片較多，請(qǐng)作精減，保留重點(diǎn)）</p><p>　　圖1 CXCR4 mRNA在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)<

90、/p><p><b>　　AB</b></p><p>　　圖2 CXCR4蛋白在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)（問題16：請(qǐng)參照近年本刊格式，分別寫明AB是什么？A中各條帶是什么？分子量是多少？寫明B圖橫縱坐標(biāo)中文標(biāo)目及單位，提供B圖的含±s數(shù)據(jù)的EXCEL文檔，便于我們后期制圖）</p><p><b>　　pRNAT-M1：</

91、b></p><p><b>　　pRNAT-M2</b></p><p><b>　　pRNAT-MN</b></p><p>　　圖3 構(gòu)建的CXCR4表達(dá)載體測(cè)序圖（問題17：可否進(jìn)行刪減？）</p><p>　　圖4 1#，2#，N#質(zhì)粒G418篩選后細(xì)胞普通顯微鏡（上）和熒光顯微

92、鏡下（下）觀察（問題18：放大倍數(shù)？）</p><p>　　圖5 CXCR4 shRNA表達(dá)載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)影響</p><p>　　*，P<0.05,與pRNAT-MN細(xì)胞相比（問題19：圖片較多，建議將4個(gè)±s數(shù)據(jù)及其統(tǒng)計(jì)分析寫入正文中恰當(dāng)位置，刪去圖5。）AB</p><p>　　圖6 特異性CXCR4 shRNA對(duì)

93、Miapaca-2細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的作用</p><p>　　*，P<0.05,與pRNAT-MN細(xì)胞相比（問題20：修改同問題16，或者建議A圖修改，然后將B圖中4個(gè)±s數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理寫入正文中恰當(dāng)位置，刪去圖6B。）</p><p>　　圖7 MTT法分析不同組細(xì)胞之間細(xì)胞增殖情況的變化（問題21：參照近年本刊格式補(bǔ)充圖7橫縱坐標(biāo)標(biāo)目、單位，圖中加標(biāo)志，圖下注

94、明統(tǒng)計(jì)學(xué)處理）</p><p>　　(問題22：參照本刊圖題重寫，染色方法×放大倍數(shù)？)</p><p>　　圖8 CXCR4干擾細(xì)胞與對(duì)照組之間侵襲能力的比較，*, P<0.05,與pRNAT-MN細(xì)胞相比。a, pRNAT-MN在10%FBS的培養(yǎng)基；b, pRNAT-MN在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基；c, pRNAT-M1在10%FBS的培養(yǎng)