1、大氣環(huán)境中包含多種環(huán)境污染物，其中顆粒物和臭氧是較為常見的污染物。城市中顆粒物在交通高峰期濃度達(dá)到最高，臭氧是氮氧化物(NOx)和揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)的二次污染物，與光照有關(guān)，一般在下午的時(shí)候達(dá)到最大值。在一天當(dāng)中，兩者的聯(lián)合暴露會(huì)發(fā)生，而暴露于多種不同的環(huán)境污染物對(duì)健康的損害效應(yīng)可能比暴露于單一污染物的毒性作用更強(qiáng)，所以無論是對(duì)流行病學(xué)研究，還是對(duì)毒理學(xué)的生物機(jī)制研究來說，考慮兩者的聯(lián)合暴露對(duì)健康的影響有重要意義。根據(jù)以往的研究結(jié)

2、果，既然顆粒物引起的心血管效應(yīng)機(jī)制涉及肺、心臟和血管系統(tǒng)等多個(gè)部分，因此我們并行檢測(cè)肺、心臟和動(dòng)脈的改變以評(píng)價(jià)臭氧和PM2.5暴露對(duì)肺、心血管系統(tǒng)的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制。
　　直到目前為止，對(duì)于評(píng)價(jià)人類暴露于多種環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)仍然沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。我們的研究中采用亞急性的暴露（2次/周，共3周）來評(píng)價(jià)由不同劑量的PM2.5單獨(dú)暴露或者臭氧與不同劑量PM2.5聯(lián)合暴露對(duì)Wistar大鼠肺、心血管系統(tǒng)的損傷效應(yīng)。我們采用每次4小時(shí)

3、的0.8ppm臭氧暴露和三個(gè)劑量的PM2.5（0.2、0.8和3.2mg/只）暴露。具體的暴露方法是，48只7周齡Wistar大鼠隨機(jī)分為8組，每組6只。PM2.5低、中、高劑量組每只動(dòng)物分別經(jīng)氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細(xì)顆粒物。臭氧和PM2.5聯(lián)合暴露低、中、高劑量組為大鼠先暴露于0.8ppm的臭氧4小時(shí)，然后再氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細(xì)顆粒物。對(duì)照組為滴注相同體積(0.20ml)的生理鹽水，臭氧單獨(dú)暴露組為先0

4、.8ppm臭氧暴露4小時(shí)，然后滴注相同體積的生理鹽水。暴露前和暴露期間每周稱體重一次。暴露3次（暴露中期）24小時(shí)后，麻醉動(dòng)物，進(jìn)行心電圖(ECG)記錄，分析低頻(LF)、高頻(HF)、低頻/高頻(LF/HF)、總變異(TV)等反應(yīng)心率變異性(HRV)的參數(shù)。末次暴露24小時(shí)后，麻醉動(dòng)物，頸動(dòng)脈插管測(cè)定血壓(BP)，同時(shí)進(jìn)行心電圖(ECG)記錄，分析HRV參數(shù)。然后腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物，分別收集全血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。檢測(cè)B

5、ALF中肺炎癥損傷指標(biāo):腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分類計(jì)數(shù);肺上皮損傷指標(biāo):乳酸脫氫酶(LDH)的活性和堿性磷酸酶(AKP)活性;肺滲透性指標(biāo):總蛋白(TP)和白蛋白(TLB);肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo):超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量;肺血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo):實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、

6、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、和細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)mRNA基因表達(dá)及比色法測(cè)定BALF中一氧化氮(NO)。心臟血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo):實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定iNOS、eNOS、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和ICAM-1mRNA基因表達(dá);心臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo):SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量。檢測(cè)胸主動(dòng)脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達(dá)。測(cè)定血清中系統(tǒng)炎癥指標(biāo):ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和C-

7、反應(yīng)蛋白（CRP），比色測(cè)定LDH和肌酸激酶(CK);系統(tǒng)氧化應(yīng)激指標(biāo):血清MDA;內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo):ELISA法檢測(cè)血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)、血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血清NO含量。取主支氣管、未灌洗的左肺、右心室心室肌和胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色組織學(xué)檢查，其中肺組織和心臟組織也通過透射電鏡(TEM)觀察超微結(jié)構(gòu)。分析肺與心血管系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與心率變異性和炎癥反應(yīng)與血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性。另

8、外，我們也分析了PM2.5單獨(dú)暴露和臭氧與PM2.5聯(lián)合暴露的肺、心血管毒性的暴露-反應(yīng)關(guān)系及兩種暴露方式的暴露-反應(yīng)相關(guān)性是否一致，進(jìn)而分析在肺及心血管系統(tǒng)內(nèi)部及兩者之間的分子病理機(jī)制的關(guān)聯(lián)性、臭氧暴露對(duì)顆粒物毒性效應(yīng)的影響及毒性作用通路的變化。
　　該研究的結(jié)果表明，在我們的研究中，臭氧和PM2.5暴露延緩了大鼠體重的增長(zhǎng)。PM2.5單獨(dú)暴露組的BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯增加。PM2.5的滴注引起肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、

9、LDH和總蛋白含量的明顯增加(P＜0.05)。臭氧單獨(dú)暴露沒有引起這些肺損傷指標(biāo)的顯著變化。但是，臭氧可以提高由PM2.5引起的大鼠肺組織的炎癥和病理改變。與對(duì)照組比較，不論是顆粒物的單獨(dú)暴露還是與臭氧的聯(lián)合暴露，肺組織中SOD和GSH-Px的活力均降低。而肺組織中反應(yīng)內(nèi)皮功能的iNOS、eNOS和ICAM-1 mRNA基因表達(dá)則有不同的變化，其中，在高劑量的PM2.5單獨(dú)暴露組和3個(gè)聯(lián)合暴露組中iNOS基因表達(dá)明顯上調(diào)，而eNOS在任

10、何一種暴露方式的作用下均沒有明顯的改變。雖然PM2.5的單獨(dú)暴露沒有引起ICAM-1基因表達(dá)的明顯改變，但是在臭氧和PM2.5的聯(lián)合作用下，肺組織中的ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)。主支氣管的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，除對(duì)照組外，其余暴露組均表現(xiàn)出不同程度的炎癥細(xì)胞增生、聚集及粘膜上皮細(xì)胞的脫落等病理變化。肺組織病理學(xué)結(jié)果表明，所有PM2.5暴露組均呈現(xiàn)不同程度的炎癥損傷，并隨暴露劑量的增加有加重的趨勢(shì)。肺的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)肺細(xì)胞的損傷主要

11、體現(xiàn)在對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞線粒體的病理影響，即造成線粒體的腫脹、空泡及增多等病變。
　　在對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷上，與對(duì)照組比較，暴露3周后，高劑量PM2.5(3.2mg/只)組的血壓明顯升高(P＜0.05)，心率則無明顯改變。PM2.5單獨(dú)暴露組可以引起血清CRP、MDA、 CK、ET-1含量和血壓的明顯增加及HRV參數(shù)的顯著降低。大鼠的臭氧單獨(dú)暴露沒有引起這些指標(biāo)的明顯改變。但是，臭氧和PM2.5的聯(lián)合暴露引起CRP,IL-6，CK，L

12、DH和MDA劑量-效應(yīng)趨勢(shì)的增加及SOD和HRV以劑量-效應(yīng)趨勢(shì)的降低。同時(shí)，在PM2.5單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露組中，ECG均表現(xiàn)出異常的放電類型。心臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露組中觀察到顆粒物的沉積，只有在高劑量的聯(lián)合暴露組中觀察到心肌炎癥。TEM的結(jié)果也表明臭氧單獨(dú)暴露、高劑量PM2.5暴露以及兩者的聯(lián)合作用可引起超微結(jié)構(gòu)的改變，主要是心肌結(jié)構(gòu)紊亂、肌絲的溶解斷裂、線粒體腫脹和空泡化。另外，PM2.5的單獨(dú)及與臭氧的聯(lián)合暴露均可

13、以上調(diào)動(dòng)脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達(dá)。說明調(diào)節(jié)動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和內(nèi)皮功能受到影響。但是在所有暴露組中，腹主動(dòng)脈的HE染色結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈的明顯病理變化。
　　肺及心血管系統(tǒng)毒性作用機(jī)制的關(guān)聯(lián)性分析表明，肺的炎癥效應(yīng)、心血管系統(tǒng)的炎癥/氧化應(yīng)激指標(biāo)與HRV參數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。血漿ET-1的含量與大鼠心臟組織中的MMP-2的表達(dá)沒有顯著的相關(guān)性，但與動(dòng)脈中MMP-2的表達(dá)顯著相關(guān)。PM2.5的單獨(dú)暴露與臭氧

14、和PM2.5的聯(lián)合暴露兩組暴露方式的暴露-反應(yīng)相關(guān)性研究表明，對(duì)于檢測(cè)顆粒物的肺毒性效應(yīng)，LDH、總蛋白、白蛋白、iNOS mRNA、SOD、GSH-PX和MDA等指標(biāo)可能更為敏感，而臭氧對(duì)AKP、IL-6、ICAM-1 mRNA等指標(biāo)的影響較大。兩種暴露方式對(duì)心血管系統(tǒng)影響的結(jié)果提示，CRP和ET-1等指標(biāo)對(duì)PM2.5暴露較為敏感，而TNF-α、IL-6和TV等指標(biāo)可能對(duì)于臭氧暴露更為敏感一些，VEGF則對(duì)PM2.5或臭氧的敏感性都較

15、差。
　　總之，這一暴露劑量(0.8ppm)和暴露時(shí)間（2次/周，共3周）的臭氧對(duì)肺及心血管系統(tǒng)的損傷較小。高劑量的PM2.5能引起大鼠肺損傷，包括細(xì)胞毒性、白細(xì)胞浸潤(rùn)、前炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激以及組織病理變化。大鼠肺的損傷主要由PM2.5所引起，但同時(shí)這一效應(yīng)可被臭氧的聯(lián)合暴露所提高。同樣劑量的PM2.5單獨(dú)暴露也可以引起心血管系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)皮功能和自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)的紊亂。臭氧和PM2.5可引起心臟組織和全身系