1、,,,分子腫瘤概論 重慶醫(yī)科大學病理教研室 王婭蘭 教授(博士生導師),,分子腫瘤概論一、有關腫瘤的基本概念（復習）腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物腫瘤生物學行為----浸潤、轉(zhuǎn)移能力 浸潤 (invasion)：起源處遷移

2、 侵入周圍鄰近組織,,轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤 （轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤）,轉(zhuǎn)移的途徑,（2）Hematogenenous metastasis 全身臟器（3）Transcoelomic metastasis 體腔內(nèi)臟器----脫落種植 （醫(yī)源性種植） 浸潤生長---惡性腫瘤生長的特點

3、 腫瘤轉(zhuǎn)移過程必經(jīng)的第一步,,腫瘤的組織結(jié)構 實質(zhì) （parenchyma)間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分1. 血管 小血管 毛細血管 血竇樣 血管球樣,,新的腫瘤血供模式---血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)1999年，美國學者Maniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式---小管狀（似血管）---管壁主要由

4、基底膜(PAS陽性)圍成，外襯以腫瘤細胞---腔內(nèi)有血漿和紅細胞流動---管道與內(nèi)皮性血管相通多存在于高度惡性腫瘤,,血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry） 腫瘤細胞構成 有基底膜 小管狀（似血管） 與血管交通,2. 結(jié)締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE ---- 紅 特殊化學染色

5、 VG 改良法---- 紅 Masson---- 蘭色 構成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應原纖維分子構成 免疫組化或分子生物學方法可區(qū)別,,,,彈力纖維 常規(guī) HE---淡紅色 特殊化學染色 Weigert或Verhceff---暗蘭或黑色，彈力 酶消化

6、后陰性,,網(wǎng)狀纖維 銀染---黑色，故也稱嗜銀纖維。 PAS ---強陽性,,成分 膠原蛋白為主要成分 細胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維--- Ⅲ型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀纖維--- Ⅳ型膠原蛋白和 層黏連蛋白（laminin）,,纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導細胞外基質(zhì)成分與細胞表面連接黏蛋白 又稱蛋白多糖（p

7、roteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin）,,（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與疾?。[瘤浸潤）關系密切 Ⅳ 型膠原 ---不形成纖維，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型膠原不同 層黏連蛋白 （laminin ,LM） ---有與細胞膜LM 受體相結(jié)合的位點,,（3）細胞成分 固有的細胞成分 ---纖維母細胞和纖維細胞

8、---肌纖維母細胞 ---間充質(zhì)細胞 ---巨噬細胞---樹突狀細胞,,反應性細胞成分 各種細胞浸潤 --- 淋巴細胞 最常見 ---漿細胞 ---巨噬細胞 都屬免疫活性細胞,,二、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制（一）腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移 1.腫瘤細胞增殖和擴展 浸潤轉(zhuǎn)移的前提和基礎 2.腫瘤血管生成(tumor angiogen

9、esis) 腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的必要條件,,3.腫瘤細胞分離脫落，與細胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細胞表面負電荷增加 （2）瘤細胞黏附力的改變 ①瘤細胞自身結(jié)構異常 ②瘤細胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細胞之間的黏附力,③瘤細胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細胞與其它不同細胞及間質(zhì)的黏附力同質(zhì)黏附力降低，有利于腫瘤細胞分離；異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過這些組織均

10、由黏附分子介導通過配-受體之間的識別和結(jié)合實現(xiàn),,（3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules) 細胞表面結(jié)構 ① 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱為鈣連接素，鈣黏素。 依賴細胞外鈣 介導鈣離子依賴性細胞與細胞（同源細胞）的黏附 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白

11、 H-cad,,②整合素(integrin)---細胞表面糖蛋白 ，約有20 多個亞型 ---各種腫瘤細胞表面整合素種類不同---腫瘤生長各個階段表達水平也不同 作用 a.介導細胞與細胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細胞之間的黏附連接 C.扮演細胞信號傳遞的角色配體-整合素-細胞骨架蛋白跨膜信息傳導系統(tǒng),,③ 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細胞

12、與細胞間的連接 ICAM-1 （細胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC,,④選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介導內(nèi)皮細胞、血小板與瘤細胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin,,⑤ CD44 及其它 CD 44(

13、透明質(zhì)酸受體) ---介導細胞與細胞外基質(zhì)粘附 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） ---血管內(nèi)皮細胞E-選擇素的配體,,4.瘤細胞的遷移(migration)及化學趨向性 (1)瘤細胞的運動 黏附；肌動蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細胞運動的調(diào)節(jié),,據(jù)其作用，大致可分為兩大類：僅影響運動的因子 遷移刺激因子（MSF）既影響運動又影響生長的因子 AMF (自分

14、泌運動因子) HGF/SF（肝細胞生長因子/分散因子),,(3)瘤細胞的化學趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子,,5.細胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤細胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細胞 鄰近的細胞外基質(zhì) 第三步 進入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi),,(2)腫瘤細胞產(chǎn)生的

15、蛋白水解酶①絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖維蛋白溶解酶(纖溶酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) 如纖維蛋白，F(xiàn)N, LM, 蛋白多糖 b. 激活膠原酶 膠原降解,,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng) A．u-PA： 介導細胞周圍基質(zhì)蛋白的降解B．u-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體

16、 活化u-PA 原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶,,,,,,C．PAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達意義不一 PAI3 功能不清,,②基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）及其

17、抑制因子 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：Ⅰ、Ⅱ型,,可分別降解ECM中各種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-

18、2 浸潤與否取決于MMP與TIMP的對比 MMP>>TIMP ECM降解才能成為可能,,③胱氨酸蛋白酶類 Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶④天（門）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D, E 在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用 CD 表達的調(diào)節(jié),,6.瘤細胞以主動方式入循環(huán)管道并形成栓子

19、微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙 血管 基底膜缺損 瘤細胞存在形式 單個 成團 同類癌栓 異類癌栓 黏附分子對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,,7.在特定器官的毛細血管滯留并黏著，再次穿過血管壁并定居、增殖 器官特異性（選擇性）機制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學趨化因子（歸巢現(xiàn)象) (3) 微環(huán)境不適合

20、(4) 與免疫狀態(tài)有關,,（二）機體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細胞主要有 NK 細胞 巨噬細胞 T 淋巴細胞 （三）腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關基因 轉(zhuǎn)移相關基因指基因的表達和改變能夠促進或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因,,（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(Epigenetics) ---與遺傳學(genetic)相對應的概念---表

21、型狀態(tài)改變，基因型不改變 ---沒有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因表達改變，導致的基因產(chǎn)物的變化。 ---1942年提出，上世紀80年代后期逐漸興起的一門新學科,,DNA的“后天性”修飾 CpG島高甲基化 癌細胞基因組低甲基化組蛋白殘基的各種修飾 磷酸化 乙?；?甲基化 泛素化等等,,（五）腫瘤干細胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006

22、年美國癌癥研究協(xié)會（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細胞的細胞,,特征 (1) 無限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號傳導途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織,,（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 腫瘤細胞間質(zhì)細胞 細胞外基質(zhì)間質(zhì)細胞所分泌的活性介質(zhì)（細胞因子） 共同構成的局部

23、內(nèi)環(huán)境,,微環(huán)境改變腫瘤細胞----自分泌和旁分泌 全身和局部組織-----代謝、分泌、免疫 結(jié)果： 限制或促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,,,三.腫瘤學研究中常用的分子生物學基本技術及其應用(一)蛋白表達異常的檢測---免疫組化（熒光）定位 ---ELISA和Western blot 、流式細胞術定量,,,,,抗體,細胞,,細胞,,細胞,,（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測方法1.酵母雙雜交法 驗證兩個已知蛋白的相互作用

24、篩選與已知蛋白作用的未知蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，,,酵母雙雜交的原理是將2個目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcription activation domain，AD）和DNA 結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會促使AD和DBD 互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進而激活事先構建到酵母基因組中的報告基因的轉(zhuǎn)

25、錄。（真核轉(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當這兩個區(qū)域單獨存在時均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當它們在空間上彼此聯(lián)系時，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。）,,局限性 ⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi) ⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”,,2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的

26、常用、經(jīng)典方法。其基本原理是:細胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復合物，然后進行SDS-PAGE及Western blotting分析。,,缺點免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過第三者間接相互作用的蛋白靈敏度不及蛋白親和色譜高必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性假陽性的概率比較高,,設置的對照包括：在對照組中

27、使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細胞系作為陰性對照等等。,,3.GST沉淀實驗（GST-pull down實驗）主要是用來證明細胞外蛋白質(zhì)相互作用利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性將GST固化在樹脂上GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細菌、動物細胞等體系中融合表達固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Bait protein)】可以捕獲細胞裂解物中的互作用靶蛋白洗脫結(jié)合

28、物后通過western blot 檢測誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,,,4.Far-Western blotting在經(jīng)典Far-Western印跡中，運用經(jīng)標記的或可被抗體檢測的“誘餌”蛋白檢測轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。用SDS-PAGE 或非變性PAGE分離含有未知靶蛋白的樣品（通常為細菌裂解液）然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后與已知誘餌蛋白孵育，運用該誘餌蛋白的特異性檢測系統(tǒng)檢測。（出相應條帶+）5.

29、生物信息學,,（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常 ---- 核酸分子生物學方法進行檢測核酸變性、復性基本性質(zhì)常用方法,,1. 核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術最常用的基本技術基本原理： --標記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe ） （同位素　P32 I125　 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） --檢測

30、靶核酸（待測核酸）中是否存在與之 同源的序列,,（1）原位雜交 （ISH）（2）熒光原位雜交 （FISH），（3）雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）（4）Southern blot (DNA 雜交)（5）Northern blot (RNA 雜交),,,2. 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction , PCR）技術 又稱體外基因擴增利用DNA變性和復性原理體外進行特定的DNA 片段

31、高效擴增 獲得或放大特異基因信號的重要手段,,擴增產(chǎn)物的檢測 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶,,Real-time PCR RT-PCR3.基因芯片技術,,(四)基因突變的檢測方法1.聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain re

32、action products , PCR-SSCP）長度相同，構象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動率）不同堿基序列不同的單鏈DNA構像改變,,基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果 可用同位素/熒光素標記 非同位素標記,,2.PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms

33、, RFLP）分析技術基本原理 --序列中一個堿基發(fā)生改變 --使原來的內(nèi)切酶位點消失或產(chǎn)生新的酶切位點--用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴增出來的DNA片段 --檢測其酶切片段長度的差異,,3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)基本原理 電泳時，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個堿基改變

34、 在不同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變,,4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6． DNA 芯片技術（DNA chip ）,,（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡單重復序列的增加或丟失 PCR + DNA 序列凝膠

35、電泳（六）腫瘤易感性檢測 采用相應基因變異方法進行檢測（七）腫瘤相關病毒 核酸雜交技術與PCR技術 (八) 基因重組技術 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (九) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術（十）RNA干涉(RNA interference）,,核酸雜交/PCR技術與蛋白表達【免疫組化/熒光、流式細胞術、WB方法結(jié)合、蛋白結(jié)合檢測

36、方法 】---蛋白表達 在翻譯水平上定位研究基因表達 ---核酸雜交/PCR技術 檢測DNA/RNA， 在基因或轉(zhuǎn)錄水平研究基因表達,,（十一）DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測1.凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）,,基本 原理： 在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳 中， D N A

37、和蛋白質(zhì)的復合物的遷移速度比單一的 D N A片段或雙鏈的寡核苷酸慢 反應產(chǎn)物 電泳分析D N A與蛋 白質(zhì)結(jié)合的特異性通過非標記D N A競爭性實驗來確定,,2.足跡實驗（foot-printing assay）原理：當DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割,而不產(chǎn)生出相應的切割分子, 在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個空白區(qū),俗稱為“足跡”.,,3.染色質(zhì)免疫共沉淀技術

38、 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）基本原理：在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物,并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,,（十二） 激光捕獲顯微切割技術(Laser capture microdissection，LCM) ---顯微鏡直視下---組織切片---確定、分離、純化單一類型細胞群或