1、1,根據(jù)臨床統(tǒng)計，25%的生理缺陷、30%的兒童死亡都是由遺傳疾病引起的。隨著分子生物學和分子遺傳學等學科的飛速發(fā)展，人們對于遺傳疾病的分子機理有了深入的了解，已經(jīng)知道人體基因的缺失、重復(fù)或突變，基因的異常表達等都會造成遺傳疾病。,2,白化病,,3,,白化病,4,,豁 唇,5,并指癥,,6,,基因突變,,鐮刀型貧血癥是一種異常血紅蛋白病。一旦缺氧，患者紅細胞變成長鐮刀型，血液的粘性增加，引起紅細胞的堆積，導(dǎo)致各器官血流的阻塞。而出現(xiàn)

2、脾臟腫大，四肢的骨骼、關(guān)節(jié)疼痛，血尿和腎功能衰竭等癥狀，病重時，紅細胞受機械損傷而破裂產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，引起溶血性貧血甚至造成死亡。,血紅蛋白四聚體,8,由于每一個基因?qū)θ说恼９δ艿挠绊懚际菑?fù)雜的，所以一種基因的變化可能會引起多種癥狀。例如，如果突變造成了某種酶活性的改變，既可能引起某種有毒底物的堆積，也可能造成某種正常細胞生活所必需的產(chǎn)物的缺乏。,9,多基因病,多基因病也與外界環(huán)境和心理因素有關(guān)，遺傳因素所占的程度稱之為遺傳度。

3、如：哮喘病遺傳度為80％、精神分裂癥為80％、高血壓遺傳度為62％ 、冠心病遺傳度為65％ 、糖尿病遺傳度（幼年型）為75％、（老年型）為35％、唇裂＋腭裂遺傳度為76％,10,第一節(jié),基因診斷,11,,基因診斷 一、概念和特點 概念：利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術(shù)方法，直接探測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平，從而對疾病作出診斷的方法。 分為DNA診斷和RNA診斷兩類。,12,分子診斷,遺傳性疾病的診

4、斷,羊水和胎盤絨毛膜檢測,13,探針雜交分析法,用途：用于診斷已知基因突變的疾病。探針：人工合成兩種寡核苷酸片段，長約16－19個單核苷酸；其中一種是正常 的，另一種含有一個突變的單核苷酸。 探針可用同位素、生物素、地高辛等標 記。樣本：血液或羊水細胞。,14,待測樣品（血細胞或羊水細胞）,,提取分離DNA,,,限制性內(nèi)切酶酶切,,瓊脂糖凝膠電泳,,轉(zhuǎn)膜，與探針雜交,,放射自顯影或顯色,15

5、,特定載體上密集的大量探針與熒光標記的樣品雜交。根據(jù)雜交信號強弱判斷基因表達強度。,16,PCR為基礎(chǔ)的診斷技術(shù),PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR－SSCP） 如果DNA分子中發(fā)生了突變，他的單鏈構(gòu)象就會發(fā)生改變，與正常的DNA單鏈相比，電泳的遷移率不同，即使只有一個核苷酸的差異，也能在電泳中區(qū)分開來。,17,PCR-SSCP的應(yīng)用檢測由于基因突變所引起的疾病如遺傳 病、腫瘤。,18,PCR－變性梯度凝膠電泳(Denatu

6、ring gradient gel electrophoresis,DGGE) 雙鏈DNA相差一個堿基，可引起解鏈溫度的細微變化，在梯度變性的SDS-PAGE中，遷移率不同，籍此檢測是否發(fā)生點突變。,19,×,MstⅡ酶切位點 （CCT GAG GAG）,5´,3´,正?；?突變基因,1.15kb,1.35kb,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,20,,0.2kb,1.15kb

7、,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,21,第二節(jié) 基因治療的歷史與現(xiàn)狀1．基因治療概念 隨著對遺傳疾病致病機理研究的深入，人們自然就想到如果能夠使變異基因和異常表達的基因變成正?；蚝驼１磉_基因，那么就可從根本上治愈遺傳疾病，這就是基因治療的基本思路。,22,,基因治療的概念：向靶細胞或組織中引入外源DNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達的基因，從而達

8、到治療的目的。,23,2．基因治療的歷史 20世紀80年代初期，美國的安德森博士首先闡明了基因治療的前景及其發(fā)展方向。 1984年，美國研究者Kohn等將載有腺苷脫氨酶（ADA）基因的病毒感染非靈長類動物，實驗表明，該基因在動物體內(nèi)的表達持續(xù)了數(shù)月。,24,基因治療方式,基因補償：以正?；蛐Ｕ蛘咛娲毕莺彤惓５幕騌NA技術(shù)：封閉有害基因的表達自殺信號途徑：引發(fā)細胞調(diào)亡，治療癌癥共刺激途徑：

9、刺激免疫系統(tǒng),25,1990年，美國批準了第一例臨床基因治療申請。患者為四歲女孩，由于缺失腺苷脫氨酶（ADA)基因而患有嚴重綜合性免疫缺陷癥，研究者（William French Anderson)將ada基因?qū)牖颊叩牧馨图毎?，然后將?jīng)過改造的淋巴細胞回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi)，治療取得了成功。,26,27,治療基本步驟:,ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入患者淋巴細胞體外擴增回輸病人體內(nèi)淋巴細胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10%

10、 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀,,,,,,28,腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID),病因:淋巴細胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年,第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH),治療策略：淋巴細胞ADA酶 恢復(fù)至正常水平的 5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀,,,,,,

11、,29,Ashanti de Silva, Now 13, was the first patient to be treated with gene therapy.,重癥聯(lián)合免疫缺陷的基因治療 腺苷脫氨酶基因治療(1990),,30,31,32,1991年美國科學家對50位黑色素瘤患者進行了基因治療，把外源的腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而達到殺死腫瘤細胞的功能，研究也取得了成功。,33,三、基因治療實例,經(jīng)過11年

12、的不懈研究，密歇根大學醫(yī)學院的研究人員成功培育出了新的聽覺毛細胞，并且恢復(fù)了聾成年天竺鼠的聽力。這項研究是尋找治療人類耳聾新方法的一個重要步驟。,34,研究人員將一種叫做Atoh1的基因插入到非感覺的上皮細胞中，這種細胞在成年的耳聾天竺鼠的內(nèi)耳中仍然存在。已經(jīng)知道Atoh1基因是聽覺毛細胞發(fā)育的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。8周后，研究人員發(fā)現(xiàn)用Atoh1處理過的動物內(nèi)耳中形成了新的聽覺毛細胞。聽力測試表明受試動物開始恢復(fù)聽覺。,Atoh1 Dir

13、ects the Formation of Sensory Mosaics and Induces Cell Proliferation in the Postnatal Mammalian Cochlea In Vivo Michael C. Kelly, Qing Chang, Alex Pan, Xi Lin1,, and Ping Chen,35,36,這項研究揭示了基因治療方法的潛力，但是同時也表現(xiàn)出

14、了基因治療的有限性，產(chǎn)生的毛細胞可以像正常細胞那樣產(chǎn)生電信號，并且與神經(jīng)元聯(lián)系；然而當幼年小鼠使用基因治療后兩周，Atoh1基因的效應(yīng)就會減弱。相關(guān)研究成果刊登在了5月9日的國際雜志Journal of Neuroscience上。,37,四川大學華西醫(yī)學中心研究人員采用反義核酸阻斷生物鐘基因表達的方法，對小鼠進行戒毒實驗，發(fā)現(xiàn)可以阻斷生物鐘基因參與調(diào)控的藥物成癮途徑，使藥物的心理成癮被克服。,38,,第三節(jié) 基因治療常用基因轉(zhuǎn)移的

15、方法一.物理方法 電穿透法：借助電流使DNA直接穿過細胞膜轉(zhuǎn)入細胞中。 顯微注射法：直接將外源基因注射入細胞中，這種方法的操作難度大，失敗率較高。 基因槍法：微細的金或鎢等顆粒，表面吸附DNA，在高壓作用下，進入細胞。,39,二.化學方法： 用一定的方法將外源DNA分子包裹成大的沉淀物，然后與靶細胞混合；靶細胞通過內(nèi)吞作用攝入沉淀物，外源基因就被結(jié)合進核內(nèi)，與染色體整合，外源基因在靶細胞

16、中得以表達。,40,三.生物學方法,常用的病毒載體　　　　逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)　　　　DNA病毒,41,病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（Viral mediated transfer）,是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細胞,,感染細胞,重組病毒,42,1．逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）載體能穩(wěn)定地將DNA插到宿主基因組的隨機位點上。能高效地感染宿主細胞，感染率可達100%。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以

17、侵染不同的細胞類型。整合的病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的外源DNA序列可以達到10kb。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因治療載體的缺點是：整合在宿主的染色體上，有潛在的致癌性。,43,2．腺病毒載體腺病毒是線狀雙鏈DNA病毒。是目前最常用的基因治療載體之一。它的優(yōu)點在于： 腺病毒比較安全，無致病、致癌、致畸作用。腺病毒的宿主范圍較廣，能感染多種細胞，因此可用于多種細胞的基因治療。腺病毒可以在呼吸道和腸道中繁殖，因而不僅

18、,44,可以通過靜脈注射的方式進行基因治療，還可以通過口服、噴霧、氣管內(nèi)滴注等簡單易行的方法進行基因治療。腺病毒可插入的外源基因可達7.5kb。人們對腺病毒的基因組構(gòu)造非常了解，以它作為基因治療的載體比較容易控制。,45,腺病毒作為基因載體也存在某些缺點： ①重組的病毒DNA是以游離的形式存在于細胞中，因而基因表達的時間較短，不能滿足基因長期表達的需要；如需進行長期表達，必須反復(fù)注射，這無疑會加重患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。 ②重

19、組腺病毒載體的反復(fù)使用，有可能會誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)，從而影響外源基因的表達，并進而影響治療效果。,46,3．單純皰疹病毒（HSV）載體單純皰疹病毒（HSV）屬于雙鏈DNA病毒。作為基因治療的載體有以下特點：單純皰疹病毒可容納高達50kb的外源基因。單純皰疹病毒的宿主范圍廣泛，可以侵染脊椎 動物的各種細胞。,47,單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性，可以用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，如帕金森氏綜合癥、老年癡呆癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療。

20、單純皰疹病毒載體是目前唯一可以將外源基因?qū)肷窠?jīng)系統(tǒng)的載體。缺點：單純皰疹病毒的某些蛋白對宿主細胞有　毒害作用。,48,4.腺相關(guān)病毒載體是單鏈線狀DNA載體。目前認為是不會引起人類疾病的病毒。宿主范圍廣，可感染分裂或非分裂細胞?？烧系剿拗骷毎娜旧w上，且位置相對固定，減少插入突變的可能性。缺點：容量小，不能超過5Kb。 包裝效率低。,49,5.嵌合病毒載體 用基因重組技術(shù)把兩種或兩種以上的病

21、毒載體序列組合，取長補短,50,5、反義核酸基因治療,反義技術(shù)：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導(dǎo)入靶細胞，阻斷Gene的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的Gene不能轉(zhuǎn)錄為mRNA 或阻斷翻譯相應(yīng)蛋白.,51,反義基因治療,DNA DNA RNA

22、 RNA 反義RNA

23、 阻斷表達,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,52,有研究表

24、明,一項試驗性治療黃斑病變的方法(即運用小RNA干擾技術(shù)來延緩中心區(qū)黃斑病變程度)可能引發(fā)一些病人失明,這種退行性病變主要發(fā)生于50歲以上的人群.某公司的臨床研究曾經(jīng)掩蓋了人們對小RNA治療弊大于利的擔憂. 加利福尼亞大學的研究人員指出:“會不會治療一種病變的同時,誘發(fā)另一種病變.”,53,體內(nèi)本身的小RNA可以通過關(guān)閉或沉默某些基因的表達來調(diào)節(jié)細胞功能。來自邁阿密的 OPKO Health和加州歐文的 Allergan兩家公司的研發(fā)人

25、員檢測了小RNA的確可以減輕黃斑病變區(qū)的炎癥;他們通過將小RNA注入病變區(qū)來抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,進而抑制炎癥加重.,54,張康的研究小組比較了600例視網(wǎng)膜萎縮和非萎縮病人之間TLR3的差異. 發(fā)現(xiàn)TLR3某些突變可以保護病人免受進一步的炎癥性萎縮。攜帶保護型突變TLR3的病人比正常基因型的病人罹患視網(wǎng)膜萎縮的危險低得多,程度取決于攜帶突變的比例.而相比之下,攜帶非保護型突變的病人則更容易被小RNA誘發(fā)出萎縮。,55

26、,這些實驗結(jié)果進一步提升了對實例研究的關(guān)注. 科學家擔心,“這種小RNA注射可能直接激活TLR3,尤其對于非突變型病例負效應(yīng)會更明顯,也就是說我們非但不能治療病變,反而引發(fā)了另外一些形式的異?！?,56,第四節(jié) 基因治療的靶細胞 基因治療的靶細胞可分為兩大類：體細胞和生殖細胞。將遺傳物質(zhì)引入人的體細胞進行基因治療的方法為體細胞基因療法（somatic cell gene therapy）；以生殖細胞為對象的基因治療稱為生

27、殖細胞基因療法（germ cell gene therapy）。,57,進行生殖細胞基因治療能使生殖細胞中的缺陷基因得到校正，使遺傳疾病不但能在當代得到治療，而且還能將校正的基因傳給下一代，最終根治遺傳疾病。,58,常用的靶細胞,造血干細胞成纖維細胞肝細胞肌細胞淋巴細胞,59,1.造血干細胞 優(yōu)點 ①對骨髓造血干細胞的了解、應(yīng)用較多 ②骨髓造血干細胞具有分裂、分化成各種 血細胞的

28、潛能 ③基因產(chǎn)物在骨髓細胞成熟后，可以通過 血液循環(huán)遍布全身 缺點 骨髓造血干細胞數(shù)量少，僅占0.1％。,60,應(yīng)用舉例 1.人β－珠蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓干細胞，再 輸入小鼠體內(nèi)，可在骨髓、脾臟和血液檢測到 人β－珠蛋白。2.將腺苷脫氨酶（ADA)基因?qū)胄∈笤煅杉毎?，在小鼠體內(nèi)長時間表達。,61,,2.成纖維細胞 優(yōu)點：①取材容易；培養(yǎng)技術(shù)成熟； ②外源基因易進入，穩(wěn)定表達；外 源

29、蛋白可隨血液供各種細胞使用。 例：將細胞因子基因（白細胞介素－12、 或白細胞介素－2）重組成逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體轉(zhuǎn)入成纖維細胞， 用于治療腫瘤 患者。,62,第五節(jié) 基因治療的應(yīng)用一.遺傳病的基因治療 目前限于某些單基因遺傳病。將外源的野生型基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，表達出相應(yīng)的產(chǎn)物，達到治療的目的。如： 嚴重聯(lián)合免疫缺陷 腺苷脫氨酶 鐮狀細胞貧血 β－珠蛋白 血友病A和B

30、 因子Ⅷ和Ⅸ,63,二 惡性腫瘤的基因治療細胞因子導(dǎo)入療法自殺基因療法腫瘤抑制基因療法,64,基因治療領(lǐng)域目前存在的問題 1. 目前已知的有治療價值的基因太少?；蛑委熓菍?dǎo)入外源基因以達到治療目的的新方法。比如針對惡性腫瘤的基因治療，能抑制腫瘤生長的基因所知不多；遺傳病中多基因疾病的基因尚不清楚，因此難以達到治療目的。,65,2.設(shè)計定向整合的載體：　　目前導(dǎo)入基因的方法不理想?；蛑委煹幕?qū)敕椒ㄒ笫歉咝?dǎo)入，

31、而且能定向地導(dǎo)入體內(nèi)某種細胞?，F(xiàn)有方法效率較低，定向性差。因此，即使導(dǎo)入的基因有治療效果，但由于導(dǎo)入數(shù)量有限，效果也有限。,66,3.如何高效持續(xù)表達外源基因 外源基因現(xiàn)有的表達量還太低，如血友病B的基因治療，凝血因子9的表達量只有正常人的5％，若能達到10％，則治療效果會大大提高。,67,4. 導(dǎo)入的基因缺乏可控性 如要導(dǎo)入一個胰島素基因并在體內(nèi)分泌胰島素依目前的技術(shù)是可以做到的，但是若導(dǎo)入的胰島素基因表

32、達分泌胰島素而不受機體內(nèi)血糖濃度的調(diào)控，將會造成嚴重后果。因此，需解決如何對導(dǎo)入基因的表達實現(xiàn)可控調(diào)節(jié)。,68,基因治療的風險,36歲的喬妮·莫爾患有風濕性關(guān)節(jié)炎，2007年2月26日第一次接受基因治療，7月2日，接受了第二次基因治療，第二天喬妮感覺周身不適，體溫上升到38.50Ｃ，后上升到400Ｃ，出現(xiàn)嚴重感染癥狀，雖經(jīng)全力搶救，但最終未能挽回喬妮的生命，7月24日，喬妮因全身廣泛性出血和肝衰竭而死亡。,69,70,71,進

33、行基因治療使用的是西雅圖的目標遺傳公司（Targeted Genetics Corp)研發(fā)的一種制劑，稱為tgAAC94,載體為腺相關(guān)病毒，攜帶一種編碼TNF抑制蛋白的基因。迄今尚未確定導(dǎo)致死亡的原因。,72,喬妮不是第一位死于基因療法的病人。1999年9月，美國亞利桑那州高中生蓋辛格因患鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(OTC)部分缺陷癥到賓夕法尼亞大學接受基因治療而死亡。FDA的調(diào)查稱，患者因免疫系統(tǒng)對介導(dǎo)外源性基因的病毒載體起嚴重反應(yīng)而死亡。